地中海贫血的遗传筛查和产前诊断

和地中海贫血的遗传筛查和产前诊断GeneticScreeningandPrenatalDiagnosisforandthalassemiainGuangdongMeizhou2006,December07徐湘民南方医科大学，医学遗传学教研室南方医院产前诊断和遗传病诊断技术中心SouthernMedicalUniversityThalassemia地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一中国南方不同高发地区人群携带率1~23%研究背景中国南方α和β地贫的人群携带率地区携带率(%)地贫β地贫广东8.532.54广西14.956.78四川1.922.18贵州—4.72台湾4.201.10香港5.023.41珠海韶关广州汕头湛江广东省五个地区地中海贫血遗传流行病学调查西南东北中JournalofClinicalPathology,2004;57(5):517-22.遗传变异Allele数%地贫染色体4788.53(--SEA)Deletion2324.14(-α3.7)Deletion1743.10(-α4.2)Deletion530.95(-αCS)Mutation100.18(--THAI)Deletion20.04(-αQS)Mutation20.04(--11.1)Deletion10.022CD118(+TCA)10.02--genedeletion10.02Undetermined20.04广东省人群中地贫的携带者频率遗传变异Allele数%β地贫染色体1982.54DeletionofCTTTatcodons41-42720.92C→Tatposition654inIVS2480.62A→Gatnucleotide-28330.42G→Aatcodon26100.13A→Tatcodon1780.09InsertionofAatcodons71-7270.09G→Tatcodon4370.09A→Gatnucleotide-2940.05InsertionofAatcodons27-2840.05-genedeletion10.01Undetermined30.06广东省人群中β地贫的携带者频率广东省年高风险妊娠预测数据（95%CI）重型或中间型β地贫：645（480，835）Bart’s胎儿水肿综合征：1714（1498，1945）血红蛋白（Hb）H病：1677（1467，1901）排序出生缺陷分析例数发生频率(/10,000)1先天性心脏病26019.662重型地贫20815.733多指20015.124肢体短缩1118.395唇裂/腭裂1098.24广州市主要出生缺陷的发生率(1998-2001)地贫纯合子：致死性出生缺陷重型地贫:胎儿水肿综合征早产死胎或出生前后死亡可导致严重产科并发症无理想治疗方法重型地贫出生后1年内发病多于未成年前因严重贫血而夭折输血和去铁治疗可维持,代价昂贵研究地中海贫血的意义重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求研究背景应用于地贫控制的人群筛查策略基于医院水平的预防计划基于社区水平的预防计划扩展的家系筛查计划中国南方地贫人群预防的首个前瞻性筛查计划时间：1993.01.01~2003.12.31基于医院的预防计划:广州市妇婴医院占广州市出生数的1/17策略：孕期杂合子筛查结合现行的孕期健康产科检查实施地贫携带者筛查及产前诊断流程被检对象（婚前或孕中期）血液学分析（MCV，HbA2变化）排除地贫地贫携带者遗传咨询，配偶检查血液学分析（MCVHbA2变化）地贫携带者排除地贫遗传咨询双亲基因分析胎儿产前诊断筛查结果异常血红蛋白阳性病例数孕妇配偶总数频率‰HbE463490.91HbH212230.43HbCS153180.34HbG*141150.28HbQ*132150.28HbN*121130.24HbD*101110.20HBNewYork8080.15Total139131522.83异常血红蛋白筛查结果年份筛查广州总筛查孕妇数孕妇数丈夫数筛查发现的检测出的完成的产前阳性孕妇数阳性夫妇数诊断数α地贫(%)β地贫(%)α地贫(%)β地贫(%)α/β地贫(%)α地贫(%)β地贫(%)1993398968393350232(5.8)129(3.2)13(3.7)8(2.3)10(2.9)12(92.3)7(87.5)1994456471617421265(5.8)164(3.6)18(4.3)8(1.9)9(2.1)16(88.9)8(100)1995390271751361227(5.8)142(3.6)17(4.7)7(1.9)12(3.3)15(88.2)7(100)1996499474460464285(5.7)181(3.6)19(4.1)8(1.7)12(2.6)17(89.5)8(100)1997439271989401250(5.7)158(3.6)21(5.2)7(1.7)10(2.5)18(85.7)7(100)1998453275378425263(5.8)172(3.8)17(4.0)8(1.9)12(2.8)17(100)8(100)1999501680141465285(5.7)186(3.7)24(5.2)8(1.7)14(3.0)23(95.8)8(100)广州市妇婴医院1993-2003筛查计划的结果年份筛查广州总筛查孕妇数孕妇数丈夫数筛查发现的检测出的完成的产前阳性孕妇数阳性夫妇数诊断数α地贫(%)β地贫(%)α地贫(%)β地贫(%)α/β地贫(%)α地贫(%)β地贫(%)2000449281817418256(5.7)172(3.8)21(5.0)7(1.7)16(3.8)21(100)7(100)2001452180152411254(5.6)164(3.6)17(4.1)8(1.9)12(2.9)17(100)8(100)2002469580667415260(5.6)163(3.4)16(3.9)8(1.9)11(2.7)16(100)8(100)2003412486393372227(5.5)152(3.6)15(4.0)6(1.6)13(3.5)15(100)6(100)Total4922186075845032804(5.7)1783(3.6)198(4.4)83(1.8)131(2.9)187(95.8)82(98.8)(cont’d)1234地贫携带者系列1筛查发现的阳性孕妇或阳性夫妇地贫1β地贫地贫β地贫5.7%3.6%4.4%1.8%Totalof4503couplesscreened54例Bart’s水肿儿和HbH病18例重型β地贫28041783198对83对产前诊断：187例地贫82例β地贫广州市妇婴医院1993-2003筛查计划的结果产前诊断结果地中海贫血的产前诊断胎儿取样技术DNA诊断技术-地贫的诊断-地贫的诊断羊膜穿刺(amniocentesis)抽取胎儿样品示意图DNA诊断技术多重PCR（multiplexPCR）等位基因特异性性寡核苷酸杂交（ASO）反向点杂交（RDB）变性高效液相色谱（DHPLC）多重引物延伸DHPLC（multiplexPE/DHPLC）年份主要诊断技术产前诊断例数α地贫β地贫总数PNDs1993–2003胎儿血分析126–1261999–2003超声诊断(DNA:Gap-PCR)61–611993.1–1993.12DNA:ASO杂交–771994–2002DNA:反向点杂交–70702003.1–2003.12PE/DHPLC–66用于α和β地贫产前诊断的方法(1993-2003)胎儿脐带血血红蛋白电泳图谱Patient1Patient2Patient3FetalAdultoriginA2FABart’sDiagnosisPatient1Bart’shydropsfetalisPatient2HbHdiseasePatient3thaltrait本实验室应用的主要技术技术名称应用对象Gap-PCRα地贫常见突变RDBα地贫／β地贫半变性DHPLC*α地贫／β地贫SBE/FP*β地贫常见突变PE/DHPLCβ地贫5种常见突变-链ELISAassayα地贫SEA缺失突变-50kb-10kb0kb10kb20kb30kb(--SEA)Deletion(-4.2)Deletion(-3.7)Deletion21导致α地贫的不同类型的基因缺失采用Gap-PCR进行--SEAα地贫基因缺失的基因分型--SEAα地贫缺失的基因分型结果三个α地贫家庭的产前诊断结果MNPBFaMoFeFaMoFeFaMoFeNormalHeterozygoteHomozygoteFamily1Family2Family3NormalMutant与美国商品化UBI试剂盒的对比研究TranscriptionRNAsplicingInitiatorcodonFrameshiftNonsensecodonDoubleheterozygote中国南方β地贫突变的变异类型和位置EXON1IVS1EXON2EXON3IVS2Fragmentsize:A=453bpB=364bpC=423bpOnesetofPCRconditionsDHPLC分析人β珠蛋白基因:三个PCR片段扩增IVS15’UTR123IVS23’UTRABCDHPLC的三种操作模式非变性分析（50C）双链DNA大小测定半变性分析（52-78C）突变鉴定全变性分析（78-80C）Oligo和RNA分析PCR产物的半变性分析（52-78C）WildtypeMutantHeteroduplexesHomoduplexesReferenceSamplesPCRProductsDHPLC检测β地贫突变的结果CD2/N-29/NCD2/CD14-15CD17/NCD2/CD27-28-28/CD27-28/CD2/-98CD26/NCD27-28/N-73/N-73/N-28/NFragmentACD71-72/IVS-Ⅱ-16N/NCD41-42/IVS-Ⅱ-16CD71-72/NIVS-Ⅱ-16/NCD41-42/N？CD38/NCD71-72/NCD41-42/CD41-42FragmentBDHPLC检测β地贫突变的结果N/NIVS-Ⅱ-654/NIVS-Ⅱ-654/654IVS-Ⅱ-666/NIVS-Ⅱ-654/666FragmentCDHPLC检测β地贫突变的结果RDBanalysis:applicationtorapidprenataldiagnosisforeightβthalassaemiamutations.GenotypeFatherCDs41-42(CTTT)/NMotherIVS-2-654(CT)/NFetusCDs41-42/IVS-2-654NormalcontrolN/N诊断结果基因型例数正常30杂合子(total)35CDs41-42(TCTT)/N14IVS-2-654(CT)/N8-28(AG)/N5CD17(AT)/N3CD26(GA)/N2-29(AG)/N1CDs27-28(+C)/N1Unknown/NorNormal183例地贫高风险胎儿产前诊断结果诊断结果基因型例数纯合子或双重杂合子(总数)18CDs41-42(TCTT)/IVS-2-654(CT)6CDs41-42(TCTT)/-28(AG)4CDs41-42(TCTT)/CD17(AT)2IVS-2-654(CT)/CD17(AT)2CDs41-42(TCTT)/CDs41-42(TCTT)1CDs41-42(TCTT)/CDs27-28(+C)1IVS-2-6