DNA粗提取和鉴定实验

DNA的粗提取与鉴定实验一、实验原理①DNA主要存在于细胞核②DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。③DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。⑷DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、实验材料和用具鸡血细胞液（5~10ml）；体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；蒸馏水；质量浓度为0．１g/ml的柠檬酸纳溶液；质量的浓度分别为2mol/L和0．015mol/L的氯化纳溶液（新教材不要求0、015的浓度了，都是用的2mol/L）；二苯胺试剂；铁架台；镊子；水浴锅；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（1000ml，一个，50ml、100ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。三、课前准备鸡血细胞液取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。四、方法步骤①提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液5mL～10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有1-2层纱布的漏斗将血细胞液过滤至1000mL。取其滤液。②溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。③析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14mol／L）经验值：需加约570mL蒸馏水，且分多次加入。将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。④滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上，滤液丢弃。⑤将DNA的粘稠物再溶解取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol／L的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒不停地搅拌，约3分钟，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。⑦提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入等体积的、冷却的、体积分数为95％的酒精溶液（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的白色丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。⑧DNA的鉴定取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015mol／L的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。五、讨论①两次使用蒸馏水第一次：细胞吸水胀破第一步第二次：使DNA黏稠物析出第三步②三次过滤第一次：DNA存在于滤液里第一步第二次：DNA被留在纱布上第四步第三次：DNA存在于滤液里第六步过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为1－2层③两次析出第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液含杂质多第三步第二次：用冷却的95％的酒精第七步④六次搅拌：第一、二、三、五、七、八步其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。