酵母双杂交H2Y和Y187系统protocol

2目录（一）介绍4（二）试剂盒物品清单7（三）额外附加物品列表9（四）酵母菌株11（五）酵母载体14（六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16方法简述：双杂交文库的构建和筛选17（七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18（八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19（九）构建生成cDNA文库21（十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27（十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28（十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30方法A:通过酵母配对（YeastMating）来筛选目的蛋白30方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35（十三）分析阳性相互作用结果38（十四）问题解决指南44（十五）参考文献47（十六）相关产品50附录A:双链cDNA合成的典型结果51附录B:酵母感受态的制备—LiAc法52附录C：单杂交对照载体信息53附录D：双杂对照载体信息54表格列表TableI．BDMatchmaker酵母菌株的基因型11TableII．BDMatchmaker酵母菌株的表型11TableIII．单杂交系统的载体14TableIV．双杂交系统的载体15TableV．各BD-MatchmakerDNA-BD载体的比较19TableVI．RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24TableVII．单杂交共转化的对照实验的设置29TableVIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29TableIX．双杂交转化的对照实验的设置33TableX．双杂交配对筛选的对照实验的设置TableXI．双杂交共转化的对照实验的设置TableXII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果TableXIII．用于PCR筛选菌落的AssemblingMasterMixs3图片列表Figure1．使用BDMatchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用4Figure2．使用BDMatchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用4Figure3．酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤5Figure4．构建和筛选BDMatchmaker酵母单杂交和双杂交文库6Figure5．酵母菌株AH109和Y187中的报告基因12Figure6．BDMatchmaker酵母单杂交文库的构建和筛选16Figure7．BDMatchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选17Figure8．用BDSMART技术合成高质量的dscDNA21Figure9．BDCHROMASPIN纯化柱和收集管26Figure10．通过酵母重整合作用来构建AD融合文库27Figure11．为双杂交筛选AD融合文库32Figure12．分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略39Figure13．通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作用42Figure14．用对照用人胎盘PolyA+RNA合成双链cDNA51Figure15．p53HIS对照载体的图谱53Figure16．pGAD-Rec2-53AD对照载体的图谱53Figure17．pGADT7-RecTAD对照载体的图谱54Figure18．pGBKT7-53DNA-BD对照载体图谱54Figure19．pGBKT7-LamDNA-BD对照载体图谱554（一）介绍BDMatchmakerTMLibraryConstruction&Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BDMatchmakerTMSystems和BDSMARTTMcDNASynthesis的技术，只需要用任何组织的1μgpolyA+RNA或totalRNA就能构建cDNA文库。通过一般细胞内克隆步骤，你能利用BDMatchmakerSystems所提供的灵敏的转录方法所构建的文库来进行单杂交或双杂交实验。单杂交实验的原理——蛋白-DNA相互作用实验单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式DNA激活序列的绑定，该序列可能是处于最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。这个实验也可以用于预测或新蛋白的DNA绑定结构域的确定。通过BDMatchmakerOne-HybridSystem你可以很容易的获得这些基因表达的蛋白在BDMatchmakerOne-Hybrid实验中，潜在的DNA绑定蛋白基因是与克隆在pGADT7-Rec2（为单杂交设计的低拷贝载体）上GAL4激活结构域（AD）序列一起融合表达的。一个或多个目的DNA序列的串联拷贝被构建在pHIS2（含有HIS3营养缺陷报告基因的报告载体）。DNA绑定蛋白和目标序列的相互作用会激活HIS3的转录（Figure1），该过程要在宿主菌株Y187（组氨酸缺陷型）中进行并在缺少组氨酸的培养基生长双杂交实验的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理双杂实验分析能用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、确定疑似作用、明确结构域。在一个BDMatchmaker双杂交实验分析中，诱饵基因是与GAL4DNA（DNA-BD）绑定结构域序列融合表达的，同时其他的基因或其cDNA与GAL4激活域（AD）序列融合表达（Fields&Song,1989;Chienetal.,1991）。当诱饵与文库融合蛋白在AH109（ADE2,HIS3,lacZ,MEL1）这样的报告菌株中相互作用，DNA-BD和AD相接近结合，并激活报告基因转录（Figure2)DNA-BD和AD的融合序列是将cDNA序列克隆进酵母表达载体pGBKT7和pGADT7-Rec载体中来实现的。pGBKT7表达了与GAL4DNA-BD融合的蛋白，而pGADT7-Rec表达与GAL4AD相融合的蛋白。在酵母中，两种融合基因在组成型启动子PADH1下高水平表达的。其他的像pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge基于GAL4的克隆载体与这个试剂盒也相兼容的。pBridge载体能被用于鉴定三蛋白复合体的酵母三杂交实验。单杂交和双杂交实验分析的生物学基础单杂交和双杂交方法是基于许多真核转录因子被发现是复合组成的，它们的转录激活和DNA绑第结构域在结构上和功能上是分开的。这使研究者可以构建各种融合基因，当在酵母中表达时，能同时结合到目标DNA序列并激活下游报告基因的转录（Figure1和Figure2），BDMatchmakersystems使用的GAL4的转录激活域与DNA绑定域是被完全阐述的的转录因子（Zhu,L.&Hannon,G.J.,2000.）5双杂和单杂文库的建立和筛选双杂和单杂文库的建立和筛选由四个主要步骤组成，（注：有两个步骤遵从同样的流程）。如果想去筛选双杂交相互作用，第一步是建立一种DNA-BD融合载体。第二步是使用试剂盒所提供BDSMART试剂从你所抽提polyA和totalRNA建立cDNA文库。就酵母双杂筛选而言，如果你打算我们从预制的BDMatchmakercDNA文库选取来替代自己准备文库，可以跳过RNA分离、cDNA合成、AD融合文库构建。这些包含非常广泛组织的文库被有效的保存在甘油中或预转化到Y187酵母菌株。我们也提供一种BDMatchmaker文库服务，基于这个服务，提供给我们你想筛选的组织与细胞，我们为你制作AD融合文库。请注意，我们尽管在高拷贝酵母表达载体中建立了很多的预制和预转化的BDMatchmakercDNA文库，对双杂工作非常理想的，但他们很少适合单杂分析。在单杂分析中我们推荐使用pGADT7-Rec2andpHIS2等低拷贝载体，因为他们产生较少的假阳性克隆。其次是cDNA合成，把cDNA克隆到BDMatchmakerAD克隆载体中建立一个GAL4AD融合文库，如果是建立双杂文库是pGADT7-Rec载体，单杂则是pGADT7-Rec2载体。克隆在细胞内通过同源重组来进行的，这一步利用酵母替内高效重组系统使dscDNA和相应的GAL4AD质粒融合。采用重组介导的克隆，文库的构建和筛选能紧密的完成，而不需要任何的细菌转化和扩增步骤。简单的把cDNA文库和相应的BDMatchmaker载体转化到酵母中，然后把细胞用于成分缺省培养基筛选双杂作用。Figure3.酵母单杂和双杂筛选的一般步骤，更加详细单杂和双杂筛选流程图，请参考Figures6and7.6Figure4.BDMatchmakerTM单杂和双杂文库筛选与构建.如这个图表所示，Asthisdiagramshows,重组介导克隆使文库构建和筛选更快捷高效，尽管这里没有显示，双杂文库能通过酵母融合筛选（细节参照SectionXII）.BDSMARTTM的cDNA合成和扩增，请参照SectionIX.pGADT7-Rec被用于双杂文库构建和筛选而pGADT7-Rec2被用于单杂文库构建和筛选。被pGADT7-Rec[2]所显示的两个相关载体有不同复制元件。更多的信息请参照SectionX和相关的载体信息包.i7（二）试剂盒内试剂列表此试剂盒包含有足够试剂能制备5次单杂或5次双杂文库。去离子水、BDCHROMASPIN柱,、NaCl溶液、缺省(DO)补充物、NaOAc、LiAc、PEG、TEBuffer,、YPDPlus培养基在室温下保存；.酵母菌株、对照PolyA+和BDSMARTIIIOligo保存在–70°C，其他试剂储存在–20°C.下。cDNA第一条链合成cDNA扩增Trial–SizeBDAdvantageTMPCR试剂盒cDNA纯化单杂交文库构建8双杂交文库构建BDYeastmaker酵母转化系统9（三）自备材料下列试剂自备，无其他特别要求所有的试剂与溶液均储存与室温下。cDNA第一条链合成无菌0.5ml离心管PolyA+ortotalRNA矿物油热循环仪DNAmarker(1-kbDNAladder)1.2%Agarose/EtBrgelcDNA的分离1.5ml无菌离心管带有小架子环型支架95%乙醇（-20℃）1%氯代二甲苯诱饵质粒构建E.coli感受态细胞。像DH5αorBDFusion-Blue感受态细胞T4DNA连接酶10XT4连接bufferLB/amp平板50mMNaCl从E.coli转化子中提取质粒的试剂盒酵母转化（在无菌容器中准备试剂）PEG/LiAc溶液1.1XTE/LiAc溶液二甲亚砜10酵母的培养与配对YPD培养基(参照YeastProtocolsHandbook)YPDA培养基（添加30mg/Ladeninehemisulfate，参照YeastProtocolsHandbook）TEbuffer或者无菌的蒸馏水适合转化的无菌试管和烧瓶100-和150-培养平板无菌玻璃棒，用于扑板弯曲的吸管X-α-Gal（用于酵母双杂MEL1表达的蓝白筛选）有agar的MinimalSDBase和没有agar的MinimalSDBase3-AT（抑制SD缺省his培养基背景生长）Kanamycin储存液（50mg/ml）保存于-20℃Ampicillin储存液（50mg/ml）保存于-20℃文库长期保存100%甘油YPD冷冻培养基（25%v/v甘油）酵母双杂文库的构建与筛选BDMatchmakerTwo-HybridLibraryConstruction&ScreeningKit不提供下列缺省补充物。用户必须自己从其他公司购买或者按照YeastProtocolsHandbook的附录C的配比自己准备。TrpDOSupplement–His/–Leu/–TrpDOSupplement–His/–TrpDOSupplement–Ade/–TrpDOSupplementPCR克隆筛选BDMatchmakerGAL4ADLD-InsertScreeningAmplimerSet11IV．酵母菌株酵母生长和保藏的其它信息，请参考YeastProtocolsHandbook。我们也推荐Guthrie&Fink的GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology(1991)和Heslot&Gaillardin的M