第五章-体内药物分析-药学

1第五章体内药物分析章飞芳华东理工大学药学院2020年3月20日2主要内容体内样品分析的前处理常用体内样品的制备与贮藏23331体内样品分析方法与方法验证DistributionMetabolismAbsorptionExcretion生物样品中药物的分析测定是定量描述药物体内过程、获得药代参数的重要手段之一。药物在体内作用定义：体内药物分析，又称体液药物分析、生物药物分析，是通过分析手段了解药物在体内数量与质量的变化，获得各种药物动力学参数，代谢的方式和途径等信息。体内样品的特点体内样品（1）采集量少。（2）药物浓度很低，一般血药浓度在10-6-10-9g/ml之间。（3）干扰物质多。药物经过代谢可产生一种或多种代谢物，母体药物和代谢物又能同生物大分子结合。与常规药物分析相比，体内药物分析在灵敏度和选择性等方面有较高的要求。体内样品分析需经分离、浓缩、化学衍生等样品前处理对分析方法的专属性、灵敏度要求高分析工作量大、数据处理复杂体内药物分析特点第一节常用体内样品的制备与贮藏一、常用品种的种类体内样品脏器组织体液血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、毛发、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等(一)血液(1)血浆全血中加入抗凝剂(肝素、枸橼酸、草酸盐、EDTA等），经离心后取上清液。（2）血清全血不加抗凝剂，由血液中纤维蛋白原等影响下,引起血液凝结而析出的澄清黄色液体,离心后取上清液。（3）全血加入抗凝剂混匀，以防凝血。二、体内样品的采集和贮藏血清比血浆只是少一种纤维蛋白原C血浆=C血清血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%-60%（血清为全血的20%-40%），多数用血浆进行分析。血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品(二)尿样尿药测定主要用于药物剂量回收，药物肾清除率、药物体内代谢及生物利用度研究。自然排尿(三)唾液唾液中的药物浓度通常与血液浓度相关，可用唾液中的药物浓度来反应血浆浓度。唾液的采集一般是在漱口后15分钟，收集，离心后，取上清液。12（四）器官组织（tissue）1．匀浆化法加入一定量的水或缓冲液，在刀片式匀浆机中匀浆，使被测药物溶解，取上清液供萃取用—方法简单、但回收率低组织处理的一般方法有：用于动物试验临床服用药物引起中毒死亡2．沉淀蛋白法在组织匀浆中加入蛋白沉淀剂，沉淀蛋白质后取上清液供萃取用，操作简单、但回收率低，较为常用153．酸水解或碱水解组织匀浆中加入适量的酸或碱，置水浴中加热，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用适用对热稳定的药物，应用较少。组织匀浆中加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用最常用的酶—枯草菌溶素（一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在pH7.0~11.0较宽的范围内使蛋白的肽键降解，在50~60℃具有最大活力）4．酶水解法优点—酶解法操作简便—避免药物在酸及高温下降解—对与蛋白结合紧密的药物，可显著改善回收率—可用有机溶剂直接萃取酶解液而无乳化现象生成缺点—不适用于在碱性下易水解的药物（五）头发（hair）应用—体内微量元素含量测定—用药史的估计—临床用药和药物非法滥用的区别—毒性药物检测优点—取样方便、可重复缺点—预处理繁杂、干扰多—分析对象的含量低、需精密仪器毛发样品的制备1．毛发中药物的提取—常用方法：直接用甲醇提取酸水解(0.1mol/L盐酸)碱水解(1mol/L氢氧化钠)酶水解(-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶)2．有机破坏法返回第一节血浆和血清都必须在采血后即时分离。否则，血凝后冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，而阻碍血浆或血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1-2d)冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃)中长期保存尿样宜立即测定，否则应加入防腐剂或低温冷藏。三、样品的储存第二节体内样品分析的前处理21一、生物样品预处理的目的使药物从缀合物及结合物中释放——测定药物的总浓度使样品纯化——消除生物基质中内源性物质的干扰提高检测灵敏度——适应和符合测定方法要求的灵敏度防止分析仪器的污染和劣化——提高分析仪器的耐受程度、改善分析结果为什么要进行前处理?为什么要进行前处理?待测生物样品的类型决定样品预处理方法：血浆、血清——常需去除蛋白质唾液——主要采用离心沉淀除去粘蛋白尿液——常采用酸或酶法使缀合物水解头发——需要将头发进行有机破坏后测定微量元素1.去除蛋白质法溶剂沉淀法中性盐析法强酸沉淀法热凝固法2.分离与浓集液相萃取法液固萃取法超滤法3.缀合物的水解酸水解法酶水解法容剂解法4.化学衍生法气相色谱：硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化液相色谱：紫外、荧光、非对映衍生化第三节定量分析方法的验证（一）特异性（专属性）内源性物质不得干扰原药、特定的活性代谢物（二）标准曲线r≥0.9900，至少5个浓度，不许外延（三）精密度和准确度RSD≤15％、20％(LLOQ)相对回收率85～115％（80～120％）定量分析方法的验证－生物样品分析（四）最低定量限LLOQ3~5倍t1/2，或1/10～1/20倍Cmax（五）样品稳定性室温、冻融、冰冻长期（六）提取回收率（绝对回收率）一般低于100％，须稳定（七）质控样品已知浓度样品均匀放入待测生物样品序列中，以确保定量测定的准确度33名词解释标准物质生物介质介质效应标准样品质控样品质控样品池未知样品制备样品分析批34研究案例35大鼠血清样品中马兜铃酸SPE净化及HPLC-MS含量测定研究对象36研究对象37OOCOOHNO2R1R2R1R2AAIHOCH3AAIIHHAAIIIaOHHAAIVaOHOCH3四种马兜铃酸结构式马兜铃酸净化方法38纯化方法有机溶剂萃取速度加样回收率（%）所得样品纯度液-液萃取大量乙醚，少量甲醇较慢97.3~105.0无选择性固相萃取少量甲醇快速87.1~105.693.72~97.83%常用固相萃取材料为C18，虽然对马兜铃酸的富集有一定的效果，但是对强保留物质无法有效去除。61%6%27%6%样品采集样品前处理分析测试数据处理与报告SPE分离材料的选择39血清中马兜铃酸前处理方法40样品配制活化上样洗脱淋洗氮气吹干，以200μL甲醇重溶，过0.22μm滤膜备用取血清，加马兜铃酸和内标物，作为上样液•3mL甲醇•5mL纯水•1mL样品•3mL甲醇/水（2:98，v/v）溶液•6mL三氟乙酸/甲醇（4:96，v/v）SPE洗脱条件考察41•实验分别考察了3mL甲酸/甲醇（5:100，v/v）、6mL甲酸/甲醇（5:100，v/v）作为洗脱液，结果表明，回收率仅为60.3%~62.7%。•改用三氟乙酸（TFA）作为酸性介质添加。选择三氟乙酸/甲醇（1:100，v/v）作为洗脱液，AAI回收率达到85.6%SPE洗脱条件考察421：1%TFA洗脱；2：2%TFA洗脱3：3%TFA洗脱；4：4%TFA洗脱三种SPE柱效果比较43样品添加量（ppb）C18-SAX（n=3）C18（n=3）SOLA（n=3）回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%AAI20095.58.2137.719.757.02.510078.619.063.821.055.717.1AAII100080.28.397.512.123.29.050098.113.323.148.823.524.0AAIIIa10089.16.6117.917.841.13.55091.122.033.026.748.822.5AAIVa500101.37.882.929.841.93.110092.716.242.621.940.616.8液相色谱串联质谱实验条件44母离子(m/z)子离子(m/z)分析样品(analyte)34046AAI31046AAII326236AAIIIa356266AAIVa马兜铃酸与内标物的TIC图1马兜铃酸IIIa，2马兜铃酸IVa，3萘普生，4马兜铃酸II，5马兜铃酸I四种马兜铃酸液质联用仪器条件45样品标准曲线相关系数RAAIY=0.0179X-0.07360.9892AAIIY=0.00431X+0.01770.9976AAIIIaY=0.304X+0.0280.9949AAIVaY=0.0609X+0.006150.9951样品LOQ(ng/mL)LOD(ng/mL)AAI103AAII4015AAIIIa10.3AAIVa52各马兜铃酸经SPE处理后加标回收率46成分加入量测得量回收率%（n=3）μg/mLμg/mLxRSDAAI0.020.01576.758.120.050.03672.806.450.200.14278.0010.09AAII0.050.03366.9013.330.100.07978.958.430.500.3978.406.62AAIIIa0.0020.001575.2519.210.0050.003773.607.820.020.01684.0016.23AAIVa0.010.006860.8016.820.0250.01870.603.130.10.075575.508.98小结47C18-SAX固相萃取柱对血清中马兜铃酸有较好的富集作用。在0.002~0.5μg/mL的浓度范围内，回收率为60.8~84.0%，所发展的方法简单、快速，回收率较高，达到了很好的净化富集效果。发展了多种马兜铃酸的高效液相色谱-质谱的含量测定方法，检测限为0.3~15ng/mL，定量限为1~40ng/mL，方法灵敏、线性范围宽。所发展体内药物分析方法也能很好地满足马兜铃酸血药浓度的监测。48本章小结体内药物常用的体内样品样品前处理方法方法验证内容掌握：