第三章-细胞培养专用微载体

第三章细胞培养专用微载体1．细胞培养(Cellculture)：细胞（包括单个细胞）在体外条件下的生长。2．组织培养（TissueCulture）：是指从体内取出组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。3．器官培养（OrganCulture）：指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。有关细胞培养的基本概念4．以上三个层次的培养，又可统称之为体外培养。5．细胞培养技术：就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。6．动物细胞培养技术：从动物体内取出细胞或者组织，分散成单个细胞，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，让其在体外的培养瓶或培养基上继续生长和增殖的技术。动物细胞培养技术的发展史萌芽实验：（1）1885年，德国人WRoux把鸡胚组织放在温热的盐水中维持其存活了10天。（2）1887，Arnold把白细胞收集在盛有盐水的小碟子里，观察到白细胞的运动，并存活了一段时间。实验缺陷：由于当时的培养基不理想，实验难以重复，不能断定观察到的是真正存活的健康组织或细胞。论证实验：1907年，美国胚胎学家Harrison，把蛙胚神经管区的一片组织植入蛙的淋巴血液凝块中，组织不仅存活几个星期，而且从培养的细胞中长出轴突。成功：在于实验方法的设计，防止了细菌的污染；Harrison被称为“细胞培养之父”。改进实验：（1）1910年，Burrows在悬滴培养法中用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和营养物质。事实证明它比淋巴要好得多，能使神经组织、心脏组织及皮肤生长良好。（2）Burrows继续与其他同事AlexisCarrel合作，成功地培养了成年狗、猫、小鼠、豚鼠等动物的组织。（3）Burrows和Carrel还证明，若把胚胎提取液（鸡胚匀浆的组织“汁”）与血浆混合使用，培养物可存活与生长得更好一些。Carrel的巨大贡献——细胞的传代①把无菌技术方面的知识引入细胞培养中②发明设计了卡氏培养瓶（Carrelflask)③在没有抗生素的情况下，使鸡胚心脏细胞维持生存34年，先后传代3400多次④为细胞的传代培养奠定了基础。（4）两位美国科学家W.H.Lewis和M.R.Lewis从另一个角度研究了培养技术。他们最先试图用已知成分的合成培养基取代不能正确确定其成分的天然培养基（血浆及胚胎提取液）。（5）1955年，Eagle采用一种成分确定的培养基（DMEM培养基）在添加血清的基础上，成功替代了当时普遍采用的生物体液进行细胞培养。细胞培养技术的快速发展阶段（1）20世纪40年代抗生素的发展、无菌技术的成熟，为动物细胞规模化的培养奠定了基础。（2）1962年，以Capstick等成功进行BHK细胞（幼年仓鼠肾细胞）的悬浮培养为标志，动物细胞进入了规模化生产阶段，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。（3）细胞培养始传我国是20世纪30年代。至50年代以后，细胞培养在我国逐步开展起来。动物细胞培养技术的应用1.疫苗制备：疫苗工业早期：普遍使用人工病毒感染的兔子和牛作为病毒疫苗的来源；培养细胞为病毒的增殖提供了场所。举例：（1）Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺（2）2005年11月，美国国会紧急拨款71亿美元用于预防疾病疫苗的研制，其中28亿用于细胞培养，（3）科技日报2006年7月13日讯，美国密西根州动物科学实验室的科研小组日前宣布，他们利用细胞培养技术，开发出制造人类流感疫苗的新方法。2.单克隆抗体制备1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。杂交瘤技术：将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，建立能分泌均质抗体的杂交瘤细胞系。杂交瘤技术优点：每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。3.病毒研究举例：SARS病毒的发现病料——选择敏感宿主细胞——细胞培养——形态观察研究分析——疫苗制备4.毒性检测实验（1）药物筛选（2）化学物质、放射性物质等的毒性检测5.疾病诊断、治疗（1）遗传病的产前检查（2）利用培养病毒进行基因缺损治疗（3）器官、组织培养移植举例：皮肤移植、功能细胞培养植入日本用骨髓细胞培养皮肤德研究人员用骨髓干细胞培养出精原细胞不易引发排异反应的“万能细胞”培养成功（4）生产重组蛋白6.其它方面生物科学的基础研究等。Vero细胞被成功的用来培养狂犬病疫苗、乙脑疫苗等多种疫苗，在非典期间又为研究冠状病毒做出贡献，在医药研究种广泛应用。来源：非洲绿猴肾细胞形态：上皮细胞生长特性：贴壁注释：该细胞是日本千叶大学的Y.Yasumura和Y.Kawakita于1962年3月27日从一只正常的成年非洲绿猴肾组织培养出来的。培养液：MEM（含2mML-谷氨酰胺和Earle'sBSS，1.5g/LNaHCO3,0.1mM非必需氨基酸,1.0mM丙酮酸钠），10%胎牛血清传代：吸去培养液。用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1:3至1:6为宜，传代期间培养液每周更换2-3次）冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。从国际上动物细胞培养技术的发展趋势看,主要有6个方面的发展方向:(1)开发细胞培养反应器和培养系统;(2)开发培养贴壁细胞的载体;(3)开发微囊技术(4)开发杂交、重组技术;(5)开发无血清和化学合成的培养基;(6)蛋白质浓缩和提纯技术。微载体培养应用此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。经过几十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTATB反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGenPlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。第一节采用微载体培养贴壁细胞是当前最有发展前途的一种培养模式悬浮培养的局限性1、大部分哺乳动物细胞为贴壁依赖性细胞，需要附壁培养。2、在培养过程中细胞易变异，潜在着致癌危险，培养病毒细胞有时会失去标记，使免疫能力降低，因此悬浮培养的动物细胞或生物制品主要用作诊断试剂，不宜直接用于人体。3、悬浮培养的细胞密度低。微载体培养优点●表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高；●把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；●可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；●简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；●培养基利用率较高；●放大容易；●细胞收获过程不复杂；●劳动强度小；●培养系统占地面积和空间小微载体是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。自VanWezel用DEAE-SephadexA50研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。●微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。●微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm3，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。●微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。第二节动物细胞在微载体上贴壁生长机理原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。贴壁依赖的动物细胞在微载体表面上增殖，可分为贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。三个阶段细胞能否贴在微载体表面上？一、取决于细胞与微载体接触的机率二、取决于细胞与微载体的相融性，这又是与基质表面的化学一物理性质相关。1.搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。2.细胞与微载体的相融性：是与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理PH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。细胞在微载体表面贴附的影响因素最新研究结果表明促使细胞贴壁的蛋白质分子，是冷析球蛋白（coldinsolubleglobulin）或纤粘素（Febronectin），两者均属于糖蛋白的一种蛋白质，都是血清中含有的成分。某些动物细胞，如人的成纤维细胞，能合成大量纤粘素，在无血清的情况下，也能贴壁。相反，某些细胞，如许多细胞系或转化细胞，合成这种糖蛋白的量很少，只有在培养基中外加糖蛋白，才能促使细胞迅速贴壁。在这种情况下，可以在培养基中补加血清，来提高糖蛋白含量。所以，无论微载体表面是带正电荷还是带负电荷，表面都可涂一层能吸附细胞的物质，如冷析球蛋白或纤粘素，用来加快细胞贴壁速度。冷析球蛋白和纤粘素，都是微载体和细胞间架桥的蛋白质。二价阳离子所起的作用，是作为细胞与糖蛋白结合的媒介。细胞是通过二价阳离子结合到糖蛋白上。由以上所述，细胞能通过血清中糖蛋白的架合作用，贴在带正负电荷微载体的表面上。如微载体带的是正电荷，还可通过附加的静电吸引力，使贴壁速度加快。因此，若在接种细胞株之前，预先用有血清的培养基培育微载体，能加快细胞的贴壁速度。细胞在微载体表面的生长的影响因素影响细胞在微载体表面生长的因素很多，主要有三个方面。●在细胞方面，如细胞群体、状态和类型。●在微载体方面，如微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。●在培养环境中，如培养基组成、温度、pH、氧以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。微载体培养操作要点●培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的PH与温度水平，接种细胞（对数生长期，而非稳定期）至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。●贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。●培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测