脑缺血动物模型研究..

脑缺血动物模型的制备和评价同济大学附属东方医院神经内科黄东雅急性期脑梗塞治疗理念的演变改善或增加缺血区的供血:稀释血液，降低血粘度，改善循环“时间窗”治疗溶解血栓、恢复血供、挽救半暗带区脑组织:3-6h内溶栓治疗抗血小板聚集治疗卒中单元（strokeunit）神经保护剂急性期脑梗塞治疗理念的演变神经保护剂：（1）钙离子拮抗剂:具有选择性扩张脑血管作用，改善脑缺血区的低代谢状态，抑制缺血“瀑布效应”启动，改善再灌注损伤。（3）细胞稳定剂:常用胞二磷胆碱，有神经元保护作用（4）兴奋型氨基酸拮抗剂:迄今综合评价最好的氨基酸受体损坏拮抗剂Mg2+是其中之一。硫酸镁1.0-2.5g稀释成1%浓度静滴1次/日，连用3日，应尽早应用。（5）阿片受体拮抗剂:阿片受体拮抗剂纳洛酮能改善脑缺血后的神经损伤症状，促进神经功能恢复，降低死亡率。（6）神经节苷脂制剂（GM）：改善预后（7）GABA增强剂：吡拉西坦，结果不一（8）其它:神经生长因子（NGF）脑梗塞治疗理念的演变历程在过去的15年中被世界所公认：3小时内静脉溶栓卒中单元阿斯匹林开颅减压术动物试验临床随机对照试验概述缺血性脑血管病(ICVD)约占全部脑血管病的80%,具有发病率、致残率、病死率高的特点,已成为严重危害人类健康的疾病之一。由于临床研究的种种限制,脑缺血动物模型已成为研究脑血管病损伤机制和防治措施不可缺少的工具。因此,建立最接近人类脑缺血的理想动物模型,具有重要意义。脑血流供应模式生物1.研究生命现象过程中长期和反复作为研究材料的物种2.细胞生命在发育的基本模式方面具有相当大的同一性3.用较低级位置上的物种来研究发育共同规律是可能的4.在有不同发育特点的生物中发现共同形态形成和变化特征时，发育的普遍原理也就得以建立。5.这些生物帮助我们理解生命一般规律的生物被称为“模式生物”脑缺血动物模型的意义宗旨：为人类疾病（脑缺血性疾病）研究服务要求：基因脑和血管解剖繁殖力强操作简单，重复性好物种的概念和动物分类的等级物种（Species）是动物分类的基本单位，在动物分类学上，为了将数量众多的物种进行鉴定、研究，便建立了一个科学的系统，设立了很多的等级或阶元（Category），用以表示各种动物间类似的程度和亲缘关系的远近。从上至下则为界、门、纲、目、科、属和种，形成了一个科学的动物分类系统。“没有物种的概念，整个科学便没有了”恩格斯物种的概念和动物分类的等级界：动物界Animalia门：脊索动物门Chordata纲：哺乳纲Mammalia下纲：真兽下纲Eutheria总目：灵长总目Euarchontoglires目：啮齿目Rodentia兔形目树鼩目亚目：松鼠形亚目Sciuromorpha河狸亚目Castorimorpha鼠形亚目Myomorpha鳞尾松鼠亚目Anomaluromorpha豪猪亚目Hystricomorpha发现物种的分类常用模式动物常用模式动物尽管一些体积较大的动物，如猩猩、猴、猫、狗、兔、猪都曾用于脑缺血研究，但是大多数实验室选择大鼠或沙土鼠作为研究对象。大鼠和小鼠作为模式生物的优势1.大鼠品种多，易于饲养，价格低廉2.纯种鼠属近亲交配，基因型相似，脑血管解剖和生理机能也相似3.大鼠脑血管解剖和生理机能接近于人类4.脑血管损伤部位恒定，实验重复性好5.动物存活时间长，利于脑缺血相关病理改变过程的研究6.脑体积大小适宜，易施低温固定技术和组织生化分析7.有关系列大鼠的生理、药理和生化方面的实验资料可供分析比较8.克服了体外实验无法实施再灌流的缺陷9.沙土鼠缺乏后交通动脉及完整的基底动脉环，两侧大脑供血相对独立，通过闭塞一侧或双侧CCA即可复制效果明显的同侧或双侧脑缺血模型脑缺血模型的制备全脑缺血模型局灶性脑缺血模型｝永久性闭塞缺血/再灌注大鼠脑血管解剖示意图大鼠全脑缺血模型-二血管阻断法方法：Smith等通过夹闭双侧颈总动脉(CCA)合并低血压以减少脑血流量，造成急性脑缺血。单纯结扎双侧CCA而不降低血压,则不足以使脑血流量(CBF)降低至缺血和能量代谢紊乱的程度。大鼠全脑缺血模型-二血管阻断法优点：该法手术简单,失败率低模拟了临床上休克、心功能不全、脑血管严重狭窄或阻塞合并血液低灌流引起的脑循环障碍缺点：脑缺血时限长，有时导致脑缺血后抽搐、癫痫等并发症的发生由于全身低血压严重干扰其他器官的血供及实验结果模型不能在清醒动物进行,无法进行神经行为的观察适用：探讨不完全性脑缺血对能量代射的影响，缺血性脑损伤的发病机理、评价抗脑缺血药物的疗效更有价值。大鼠全脑缺血模型-四动脉阻断法方法：Pulsinelli等在1979年通过阻断双侧CCA及椎动脉血流成功建立了四血管闭塞法大鼠全脑缺血模型。以1%戊巴比妥钠按40mgPkg进行腹腔麻醉,腹卧固定大鼠于恒温手术台,颈后正中切开,暴露第一颈椎的两侧翼板小孔,用单极电凝针插入其中,烧灼双侧推动脉,使之永久闭塞,24h后再仰卧位,局麻喉部,在喉头与胸骨间3cm处正中切口,分离暴露二侧CCA,手术缝合线打活结结扎,阻断两侧CCA使缺血30min,松开活结,造成大鼠全脑缺血再灌流模型。大鼠全脑缺血模型-四动脉阻断法优点：检验缺血是否成功的指标明确并能进行灌注实验海马损伤明显，可显示记忆功能的减退缺点：操作较复杂椎动脉和脊管前动脉间的交通支存在个体差异较大操作的熟练程度直接影响实验效果适用：该模型用于特殊领域的研究大鼠局灶性脑缺血（MCAO）模型大脑中动脉(MCA)是人群脑卒中的多发部位，MCA闭塞（Middlecerebralarteryocclusion，MCAO）模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型，主要有以下几种：栓塞法、栓线法、光化学法、开颅法大鼠局灶性脑缺血模型大鼠局灶性脑缺血模型-栓塞法方法：Kudo等采用100μm，在颈外动脉（ECA）的颈内动脉（ICA）开口处置一可逆性插管，栓子则由ICA进入MCA，导致同侧大脑皮层、海马、深层灰质结构的梗塞。材料：同源血凝快碳素颗粒塑料颗粒花生四烯酸钠大鼠局灶性脑缺血模型-栓塞法优点：可选材料多样，较好模拟脑栓塞缺点：由于栓子的随机性,无法预测栓塞的部位与大小缺血不一,不利于神经症状和脑组织定量分析不能再通与人类卒中差异较大适用：血栓形成过程的研究溶栓治疗的观察（尤其是人血凝块栓塞者更有使用价值）大鼠局灶性脑缺血模型-栓线法方法：1985年由Koizumi首次报道,近年来不断得以完善。由ECA插入4-0尼龙线进入ICA,阻断MCA起始端而导致局灶性脑缺血。通过提拉插线可以造成再灌流损伤模型。大鼠局灶性脑缺血模型-栓线法优点：急慢性局灶性缺血模型较理想的观察脑缺血再灌流损伤模型缺点：结扎枕、甲状腺上、咽升、舌、上颌外和翼腭动脉需要一定手术技巧,实质上是一种栓塞性卒中，与人类常见卒中仍有差异适用：该模型模拟了人类缺血性脑血管病的永久性及暂时性局灶性脑缺血的各种状态,在评价再灌流的作用及药物疗效时,具有说服力。大鼠局灶性脑缺血模型-光化学法方法：Watson等[8]首次建立了光化学法诱导脑皮层梗塞的动物模型。将大鼠固定在定位仪上,暴露颅骨,静脉注射光敏材料虎红酸钠,用特定冷光源(500-600nm)照射颅骨,光线透过颅骨与血管内的光敏物质接触,刺激发光化学反应的单线态氧,直接损伤血管内皮细胞而诱导血栓形成大鼠局灶性脑缺血模型-光化学法优点：该法手术创伤小,动物易长时间存活血栓形成过程与人类相似可选择皮层梗塞部位缺点：较早地导致终末动脉及微血管永久性闭塞,不利于扩血管及促进侧支循环作用的研究适用：慢性脑缺血研究抗血小板,抗血栓等药物及内皮细胞保护等的动物实验研究大鼠局灶性脑缺血模型-开颅法方法：Tamura等采用颞下部开颅，分离近端MCA，夹闭、电凝或用手术丝线结扎MCA，造成脑梗塞，是目前公认的标准MCA闭塞模型。在大鼠耳眼连线中点开口,分离颞肌,剪断颧弓,在颧弓根前方颅骨钻孔,于大脑上、下静脉间11-0外科无伤缝合线结扎MCA,造成MCA支配区局灶性脑缺血模型。大鼠局灶性脑缺血模型-开颅法优点：实验条件较恒定，缺血效果可靠以大脑皮层、尾状核缺血最明显，最接近人类脑卒中是迄今应用最广泛的经典性局灶脑缺血模型缺点：于阻断MCA的手术难度较大，需显微外科手术技术但可能形成脑脊液漏对操作过多的血管可能影响缺血后的侧支循环适用：脑缺血后长期的神经功能缺损及介入治疗和康复策略的研究同时进行生理、生化、病理形态及神经病学等指标的观察小鼠脑缺血模型的特点大多数实验动物由于颅内有侧枝循环的代偿作用因而很难造成脑缺血。近20年来,国内外均有文献报道利用小鼠（mause，mice）没有联系颈内动脉系统和椎基底动脉系统的后交通动脉的解剖学特征,可制作理想的脑缺血模型。蒙古种沙土鼠：Mongliangerbils近交系（inbredstrain）:BALB/c小鼠C57BL称远交群（outbredstock）：KM小鼠ICR小鼠NIH小鼠突变系（mutantstrain）：nude小鼠Scid小鼠小鼠前脑缺血/再灌注模型（forebrainischemic/repefusion，FbIR）用20%乌拉坦按110gPkg经腹腔麻醉小白鼠。沿颅顶正中线切开皮肤、暴露颅骨,于颅骨左侧,冠状缝和矢状缝旁开各1mm处钻洞,穿透颅骨达硬心电图标准Ⅱ导联记录心电图。结扎双侧CCA,同时将绕颈后的备线扎紧给颈部软组织逐步加压小鼠全脑缺血/再灌注模型优点：手术操作简单，创伤小缺点：沙土鼠体积小，生理反应有不稳定倾向操作技术要求高死亡发生率较高，需保持动物清醒，便于随时观察动物生理状态变化适用：用于筛选脑活性保护成分或缺血性保护剂的研究小鼠线拴局灶脑缺血/再灌注模型Welsh等建立了插线法小鼠局部脑缺血模型，在CCA分叉部的近端约2-3mm处剪一小口,插入820尼龙纤维线段,送至ICA近端后松开血管夹并继续推送直到遇到阻力不能再前进为止。激光多谱勒流量仪监测MCA。小鼠线拴局灶脑缺血/再灌注模型优点：该方法操作简单易行,避免开颅缺点:动物小，要借助手术显微镜准确的栓塞位点较难把握适用：该模型为剖析脑梗死形成的复杂分子机制提供了有力工具，由于技术要求高，应用不太广泛非人灵长目动物-猴脑缺血模型非人灵长目动物在直立的体位、行为、运动、感觉、新皮质的比例、脑血管的构筑、非骨性脑膜和右手优势等方面与人类相似。可以设想,其脑血管和组织对脑缺血的反应最接近人类卒中。因此,非人灵长目动物可能是制作脑缺血模型的最佳动物猴全脑缺血模型－四血管闭塞法(4VO)分离两侧颈总动脉(CCA)及椎动脉，在结扎双侧椎动脉后,立即夹闭双侧CCA,缺血15min后再灌注。猴全脑缺血模型－四血管闭塞法(4VO)优点：能导致严重的大脑缺血具有高度重复性缺点：易出现实验未达到预定时间而动物已经死亡的情况适用：以作为严重创伤造成的多器官衰竭,脑衰竭的模型。猴全脑缺血模型－头臂总干+左锁骨下动脉闭塞法猕猴的主动脉弓上只有头臂总干和左锁骨下动脉两个分支,夹闭这两个分支可以阻断脑部血流,从而造成全脑缺血。猴全脑缺血模型－袖带充气压颈法先气管插管,然后将小儿血压计袖带绕在颈部,充气加压,静脉注射神经节阻滞剂樟脑磺酸三甲噻吩(Trimethaphancamsylate),可以制造全脑缺血和再灌注模型。这种方法简单、可靠,但脑部动脉、静脉同时被阻断猴局灶性脑缺血模型为了长时间、反复进行实验和临床观察,非人灵长类动物单血管堵塞模型是最理想的局灶性脑缺血模型，各种方法造成MCA闭塞猴局灶性脑缺血模型大脑中动脉缺血/再灌注法经眶入路法血管夹闭法血管外气囊充气阻断血流法永久性局灶性脑缺血MCA电凝并切断法皮质梗死法介入法自体血凝块栓塞法硅胶栓子法猴局灶性脑缺血模型－经眶入路法开颅手术需要直接对脑组织进行操作,影响颅内压和动物的咀嚼等功能。采用拉线或松线可使大脑中动脉(MCA)闭塞或再通。猴局灶性脑缺血模型－经眶入路法优点：直视下完成MCA的闭塞或再通缺点：有一定难度，需精细的眼眶内操作容易损伤MCA管壁上的神经襻导致脑脊髓液漏对血管的操作可能引起血管痉挛从而难以