清华仪器分析课件--第三章 高效液相色谱分析法 HPLC

高效液相色谱法：特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。高压：150-350*105Pa高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）第三章高效液相色谱分析法HPLC（HighPertormanceLiquidChromatography，）§2-1高效液相色谱法的特点一、HPLC与GC差别1．分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%2．流动相差别的区别GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置二、高效液相色谱仪流程图三、HPLC的特点和实际应用1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂体系中的痕量组分。正相色谱分离有机溶剂中的物质反相色谱分离水溶液中的物质----生化物质。2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离子等）3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子化合物。4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。§2-2基本理论和条件选择基础理论热力学理论：塔板理论——平衡理论动力学理论：速率理论——Vander方程一、塔板理论理理nLH/22212)(16)(54.5)(WtWttnRRR理effeffnLH/221'2')(54.5)(16WtWtnRReff0'ttkR2)1(kknneff理（填充柱）：uCuBAHGC/（毛细管柱）或uCuBH/dpA2dpAgmDDB22gRDBtB，MTDTDgg或llgsmCCCCCCllDdfC2TDL1.二、速率理论（与GC对比）2）涡流扩散项及其影响（忽略纵向扩散项后）：uCAHHPLCmDB2TDm相忽略大低，流动相柱温BTRtnHuuHscmu，但柱效，时，/1min/1mlu选择兼顾柱效和分析时间，2.讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）dpA2dpA柱效，，nHAdp3）传质阻抗项及其影响）（忽略固定相传质阻抗smmssmmCCCCCC忽略固定相传质阻抗态流动相的传质阻抗注：只考虑流动相和静uCuCAHHPLCsmm：msmmDdpCC2mDdpC2TDm柱效，nHCdp柱效，nHDm，柱阻，，但易产生气泡mmDTCDT1．22114kknRuCAH流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n''''12121212RRRRVVttkkKK温影响小）质和固定相性质（受柱：调整流动相种类、性0'ttVVKVCVCWWkRmsmmssms小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相k三、影响分离的因素1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，约1ml/min3.柱温的选择：选室温250C左右四、HPLC法中分离条件的选择一、液固吸附色谱法（LSC）(liquid-solidadsorptionchromatography)二、液液分配色谱法（LLC）(liquid-liquidpartitionchromatography,chemicalbondedphasechromatography三、离子色谱法（IC）（ion-exchangechromatographyandionpairchromatography)四、空间排阻色谱法（SEC）（stericexclusionchromatography§2-3各类高效液相色谱法简介1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异分离前提：K不等或k不等)1(0mRVSKttmVSKk一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（10μm）（2）高分子多孔小球：YSG原理：吸附+分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物（1）硅胶表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶无定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108堆积硅珠YQG3~4μm8×108理想原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物3．流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂例：正己烷或庚烷+氯仿---4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，tR↓注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC•硅胶含水量较小吸附色谱硅胶极性较大•硅胶含水量17%分配色谱硅胶失活→载体吸附的水→固定液1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用固定液——极性→NLLC固定液——非极性→RLLC3．正相色谱——固定液极性流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱——固定液极性流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分二、液液分配色谱法（LLC）（一）常规化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）2．特点：不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱4、化学键合固定相（二）反相键合相固定相1．分离机制：疏溶剂理论正相——流动相与溶质排斥力强，作用时间↑，k↑，组分tR↑反相——流动相与溶质排斥力弱，作用时间↓，k↓，组分tR↓2．固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，THF4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5．出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）（三）正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相3．流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6．适用：•氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似•氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等1．反相离子对色谱法（IPC或PIC）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱四丁基季胺盐→分析酸2）影响k的因素a．与m的极性有关（同反相色谱）b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑3）适用：较强的有机酸、碱三、离子色谱法（IC）2．反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关选择流动相：应同时考虑极性及pH值酸性物质——加入酸HActR↑，k↑碱性物质——加入碱NH3·H2OtR↑，k↑调节pH范围：3.0~8.0pH8.0破坏键合相与载体的结合pH3.0腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物2．对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度k=1~10k=2~5最理想的3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气3．洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）§2-4高效液相色谱仪1．泵：恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用2．进样装置1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室）GC系统压力较小，可以HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀液相色谱3．色谱柱：直径4~6mm,柱长10~30cm柱效评价：色谱系统适应性试验R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4．检测器1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质灵敏度高3）示差折光检测器：利用折光率的差别灵敏度低，温度要求严格4）电化学检测器5）化学发光