浙江大学细胞培养-基础知识

培养前准备培养基培养设备细胞培养基础知识一、细胞培养物的生长生物学按生长方式粘附型细胞上皮细胞型成纤维细胞型游走细胞型多型细胞型各种实体瘤细胞悬浮型细胞造血系统肿瘤细胞体外细胞培养物的生长类型成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起上皮细胞：扁平、多角形、圆核可连成单层(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞1234（一）贴附(粘附)型细胞粘附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式含义：细胞与细胞间接触，细胞与细胞外基质结合。结果：细胞与细胞之间相互结合形成组织，使细胞与其周围环境间始终保持联系，使有机体内几乎不存在“自由”的细胞。培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物，乳腺外胚层消化道，呼吸道上皮内胚层内皮中胚层上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，但不完全相同上皮细胞型易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺石状生长时呈膜状移动很少脱离细胞群而单个活动上皮细胞型—生长特点成纤维细胞型名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态，梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核。排列成放射状，漩涡状不紧靠连成片，细胞与细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起成纤维细胞型—生长特点体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞具有类似巨噬细胞样的特征。经常处于较活跃的变形及游走状态，因此外形不规则且不断变化。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。表现这种形态的细胞主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞(Kupffercell)以及某些肿瘤细胞等。游走型细胞多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，细胞一般分胞体和胞突两部分：其胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样不规则。体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神经胶质细胞。多形型细胞细胞形态并非固定不变，可随培养条件、生长时期、细胞数量等而变化细胞形态只是对培养物判断或识别的参考指标若要确定某一培养物的确切细胞类型，必须借助更为特异的鉴定方法，如进行组织化学或免疫细胞化学染色鉴定。注意：培养细胞形态不稳定血清Hela高血清低血清成纤维细胞样上皮样细胞pHHela太酸或太碱标准pH成纤维细胞样上皮样细胞细胞密度3T3低密度高密度成纤维细胞样上皮样细胞生长状态改变悬浮贴附圆形成纤维或上皮样转化与否未转化转化成纤维样上皮样（二）悬浮生长型概念培养时不贴附于基质而呈悬浮状态生长，或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源自血，脾或骨髓，尤其血中白细胞，癌肿细胞也可能特点在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团优点生存空间大，提供数量多传代方便(不需消化)易于收获可获得稳定状态缺点观察不方便很多细胞不能悬浮生长(尤其正常细胞)二、培养细胞的生长和增殖过程分裂增殖和生长发育是体外培养细胞的两大生命特征增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿（一）组织培养细胞生命期(LifeSpanofCultureCells)在培养中持续增殖和生长的时间。原代培养期、传代培养期、衰退期。1、原代培养期(PrimaryCulturestage)也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。2、传代期(passagestage)特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。原代培养传代培养镜下观察选取生长良好的细胞加入胰蛋白酶消化液倒去酶液，加入培养液反复吹打制成细胞悬液按比例分装后培养一代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）体外培养细胞一代生存期潜伏期指数增生期停滞期所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。2.1游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10min-4h2.2贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟--4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）2.3潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24h。2.4对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。2.5停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性a.贴附b.接触抑制c.密度抑制培养细胞的生长特点3、衰退期特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。细胞周期M期（有丝分裂期）间期G1期（DNA合成前期）S期（DNA合成期）G2期（DNA合成后期）（二）单个细胞的生长过程三、培养细胞的生存条件培养皿或培养瓶温度、湿度和气体由CO2恒温孵育箱提供生长培养液10％～20％的血清维持培养液2％～5％的血清营养物质糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等（一）细胞的营养需要--培养基培养基的基本要求•基本营养物质：氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子•促生长因子、激素、血清等物质•渗透压：因细胞的类型及种族而异。人血浆渗透压约为290mmol/L，可视为体外培养人类细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mM左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260-320mM。•pH：大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4.•无毒、无污染培养基的种类•天然培养基：血清•合成培养基：主要是牛血清胎牛血清：取自破腹产的胎牛新生牛血清：取自出生24h的新生牛小牛血清：取自出生10-30d的小牛主要成分血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等血清：主要作用1）提供基本营养物质2）提供贴壁和扩展因子3）提供激素及各种生长因子4）提供结合蛋白5）对培养中的细胞提供某些保护作用血清：主要缺点1）改变某种细胞在体内的正常状态2）血清中含有的某些物质对细胞有毒害作用3）每个批次血清的成分不能保持一致4）取材过程中可能污染支原体、病毒等，对培养细胞产生潜在影响血清：使用前处理56oC灭活30min。储存条件一般储存于-20oC，避免反复冻融，购买大包装后，先灭活，然后分装冻存，使用前4oC融化。使用浓度一般为5-20%，最常用为10%。血清：低限量Eagle培养基，仅含有12种2必需氨基酸、谷氨酰胺，8种维生素及必要的无机盐。成分简单，易于添加某种特殊成分适应某些特殊细胞的培养。MEM(minimumessentialmedium)：由Dulbecco等人研制，在MEM基础上增加了各成分的用量，分为高糖型（葡萄糖4500g/L）和低糖型(葡萄糖1000g/L)，高糖型有利于细胞停泊在一个位置生长，适合于生长较快。附着较困难的肿瘤细胞。DMEM(Dulbecco'smodifiedEaglemedium)：由Iscove等人在DMEM基础上增加了许多非必需氨基酸及一些维生素，增加了HEPES，葡萄糖含量为高糖型。适合于细胞密度较低，细胞生长较困难的情况，如杂交瘤细胞的筛选培养，DNA转化后细胞的培养。IMDM(Iscove'smodifiedDulbecco'smedium)：由Moor等人为培养小鼠的白血病细胞而设计，特别适合悬浮细胞，尤其是淋巴细胞的培养，组分较简单，目前配方适合多种细胞的生长。RPMI1640：由Morgan等人为培养鸡胚组织而设计，几乎含有所有氨基酸、维生素、生长激素、核酸衍生物等。109比199效果更好。199、109medium：由Ham针对小鼠二倍体细胞克隆化培养而设计，并逐步改良后也适合人二倍体细胞的培养，F12在F10配方基础上增加了一些微量元素和无机离子，特别适合进行单细胞分离培养。HamF10、HamF12medium：由MeCoy等人专为肉瘤细胞研制的培养液，后发现特别适合原代细胞培养，尤其是较难培养的细胞生长。MeCoy's5Amedium：一般以HamF12和DMEM按1:1混合作为基础培养液；在基础培养液中添加促贴壁物质、促生长因子及激素、酶抑制剂、结合蛋白和转运蛋白、微量元素等。无血清培养基：均不含有动物蛋白；CDM培养基中添加了一些已知结构和功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。无蛋白培养基(proteinfreemedium,PFM)限定化学成分培养基(chemicaldefinedmedium,CDM)：培养基的选择1）建立某种细胞株所用的培养基应是首选，可查阅文献或向卖家咨询；2）本实验室惯用的培养基，许多培养基可适合于多种细胞；3）根据细胞株的特点、实验的需要选择培养基；如小鼠细胞株多选RPMI1640，进行细胞杂交、转染可选IMDM4）用多种培养基分别培养目的细胞，根据其生长状态选择培养基。培养基的配制1）认真阅读说明书；说明书中注明干粉中不包含的成分，如NaHCO3，谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等2）配制时要保证充分溶解。NaHCO3、谷氨酰胺等物质要在培养基完全溶解后才能添加；3）配制所用的水为双蒸水或三蒸水，离子浓度很低；4）所用器皿应洁净无菌；5）配制好的培养基应马上过滤除菌，存于-20oC或4oC。制备1000mlRPMI-1640培养基RPMI1640干粉培养基10.4g（1包）+蒸馏水400ml↓磁力搅拌至完全溶解↓加三蒸馏水定容至1000ml↓滤过除菌，并分装成200ml/瓶，-20℃冻存酚红大多数培养液中使用酚红作为pH指示(黄--红--紫)0.4％酚红溶液：称取0.4g酚红，置玻璃研钵中细研，逐滴加入0.1mol/LNaOH边滴边研至酚红完全溶解，记好加NaOH的量，共加11.28ml，将研好的酚红液用吸管移入烧瓶中加三蒸水88.72ml，高压灭菌。在一些特殊培养液中不含酚红哺乳细胞培养液：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用流式检测细胞培养液：酚红干扰检测维持液与生长液维持液：合成培养基中不加血清或加低浓度（如2％）血清，仅能维持细胞生存，细胞不能很好生长。生长液：合成培养基中加入10-20％血清，有利于细胞生长。［附］RPMI-1640生长液和维持液配法维持液：RPMI-164095％小牛血清2％谷氨酸胺（100×）1％双抗（100×）1％用NaHCO3调pH至7.0-7.2。生长液：RPMI-164088％小牛血清10％谷氨酸胺（100×）1％双抗（100×）1％用NaHCO3调pH至7.0-7.2。其它培养用液平衡盐溶液消化液pH调整液抗生素液谷氨酰胺补充液几种常用的平衡盐溶液的配方(g/L)BingerPBSTyrodeEarleHank'sD-Hank'sDulbeccoNaCl9.008.008.006.808.008.008.00KCl0.420.200.200.400.400.400.20CaCl20.25-0.200.200.14-0.10MgCl2·6H2O--0.10---0.10MgSO4·7H2O-