11DNA重组技术的基本工具文

乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)转鱼抗寒基因的番茄转基因抗虫棉抗虫棉普通棉DNA重组技术的基本工具1.复习：（1）基因工程的概念基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达基因重组（2）有关基因工程概念理解2.复习：（1）基因工程培育抗虫棉的简要过程普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)问题1：上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？（2）基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接关键步骤三：抗虫基因导入受体(棉花)细胞问题2：解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：基因的剪刀——限制酶基因的针线——DNA连接酶基因的运载工具——运载体DNA重组技术的基本工具本节知识内容§1DNA重组技术的基本工具新授课：专题一基因工程“分子手术刀”──限制酶“分子缝合针”──DNA连接酶“分子运输车”──基因进入受体细胞的载体识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是从原核生物中分离纯化4000种。1、来源：2、种类：3、作用：4、结果：形成两种末端一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶粘性末端平末端专一性大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制酶什么叫黏性末端？限制酶•什么叫黏性末端？•什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。什么叫平末端？当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。•要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。•如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端。二、“分子缝合针”——DNA连接酶1、种类：2、作用部位：两类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶磷酸二酯键DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。问题3：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键，那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。•外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？“分子运输车”——载体。•载体的作用有哪些？作用一：将目的基因转移到受体细胞中去。作用二：目的基因随载体的复制而复制。三、“分子运输车”—基因进入受体细胞的载体：常用的载体主要有两类：1）质粒2）噬菌体或某些动植物病毒原理：病毒，细菌等的侵染性。三、“分子运输车”—基因进入受体细胞的载体：了解质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，且具有自我复制能力的双链环状DNA分子。质粒是基因工程最常用的运载体。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。提问：所有的质粒都可以作为运载体吗？•作为运载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。2）具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。4）对受体细胞无害。5）大小应适合，便于提取和体外操作为什么质粒可以作为基因工程最常用的运载体呢？基因操作的工具一.“分子手术刀:限制性核酸内切酶来源:主要来自原核生物作用:将外来的DNA切断结果:产生黏性末端或平末端二.“分子缝合针”:DNA连接酶分类:E·coliDNA连接和T4DNA连接酶作用:把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来三.“分子运输车”:基因进入受体细胞的载体种类:质粒、动植物病毒等条件:自我复制、限制酶切点、标记基因、安全的、大小应适合1.有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种B、重组DNA的形成在细胞内完成C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、质粒都可作为运载体BD练习2）以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来C3）下列不是基因载体具备的条件的是A、能自我复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD4）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性核酸内切酶可用于目的基因的获得C、目的基因须由载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A2和7能连接形成…ACGT……TGCA…；4和8能连接形成…GAATTC……CTTAAG…；3和6能连接形成…GCGC……CGCG…；1和5能连接形成…CTGCAG……GACGTC…。教材P7思考与探究12.提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵3.提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒，即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。T磷酸二酯键1234512345A