基因质粒的邮寄和收获方法

基因质粒的邮寄和收获方法：为了安全和方便运输，建议同志们将质粒或基因等资源先点到膜上，风干后走EMS或挂号或其他快递公司投递。点膜：在滤纸（最好灭菌）上用铅笔画一直径0.2cm-0.4cm圈，将一定体积的质粒点在圈内（比如10ul），自然风干后置于自封袋中即可寄样；复溶：方法是将画圈的滤纸剪下，置于管中，加一定量的TE溶解（原则：够覆盖整个滤纸并最终能从中吸出10-20ul液体的量就行。），溶解30分钟后取出溶液。转化：方法是取5ul溶液做转化（步骤采用做普通连接物的转化）。还建议酷友们将基因导入通用载体（比如PET32a、T载体等）后，以邮寄质粒的方式投递。补充说明：一、质粒邮寄和收获方法：将TE或双蒸水融解的液态质粒溶液约10-20ul点在用铅笔画好的半径约为2毫米的洁净慢扩散型滤纸的圆心处，风干后放入干净的自封袋内置于4摄氏度冰箱内，1天内以快递方式邮寄。二、质粒邮寄和收获方法：收到滤纸后，将铅笔画有标记的部分（不含有铅笔笔迹部分）剪下后用干净的镊子夹入1.5mleppendoff离心管中用10-20ulTE或双蒸水充分融解,期间可用移液器反复吸打，最后12000rpm离心3-5分钟取上清5ul转化即可，同时该离心管保藏在-20摄氏度以备转化失败再次使用。大肠杆菌菌株的邮寄和收获方法：1.穿刺保藏（推荐方法）穿刺保藏是个菌种保藏和运输的最佳选择，尤其是对于对宿主有特殊要求的质粒，方法很简单，就用培养该菌株的固体培养基融化后无菌状态下加入相应抗性后取500ul左右到1.5灭菌离心管中，冷却后用接种针沾取少量菌液穿入培养基内，选择不同穿刺入口反复几次后盖上盖子，在该菌株的适宜培养温度下培养1-12个小时，一般选择3小时即可（其实无所谓，就是菌复壮一下，和平板培养一样得道理,毕竟菌在运输过程中还会继续长）。随后封上封口膜，放在4°冰箱等待邮寄。收到后无菌条件下挖一块含有保藏菌株的培养物放到液体培养基里培养一定时间后画线分离单菌落即可。2.甘油菌保藏甘油保藏也是菌株保藏和运输的常用方法，但保藏物为液体，不易邮寄且4°无法放置过久。具体保藏方法如下：1.5ml离心管中取对数增长期菌液425ul加入的75ul的无菌甘油使甘油终浓度为15%，混匀后放置－70°保藏，邮寄前取出用手握住管底菌液迅速将其融化封上封口膜即可邮寄。收到后无菌条件转接菌株培养物到相应液体培养基里培养一定时间后画线分离单菌落即可。注：为了防止交叉污染，建议一个资源用一张滤纸并用单独的自封袋。感受态细菌的制备和转化（From分子克隆）1.从平板上挑取一个已经在37℃生长16~20h的单菌落（直径2~3mm），接种到3mlLB液体培养基中，37℃250rpm振荡培养12小时左右至对数生长期，停止培养。（有的书说：待培养液呈云雾状，OD600为0.3~0.4，停止培养。）2.将该菌悬液以1:100的比例转接于LB液体培养基中（eg吸取0.5ml接种于含50mlLB的锥形瓶中），37℃250rpm振荡培养2.5h。（有的书说：当培养液开始出现混浊后，每隔20~30min测一次A600nm，至A600nm小于或等于0.7时停止培养。）将菌液置于冰上放置15min以上。3.用已预冷的离心管分装菌液（2个50ml的离心管每个装25ml菌液）。0~4℃，4000rpm离心10min。倒出上清培养液，并将离心管倒置在滤纸片上1min，使残留的培养液流尽。(注：要将LB液去尽，否则会影响感受态效果，但又不能让细胞回温。可用吸水纸吸尽管口附近的LB液，再用无菌棉签小心擦出管内残液，整个过程要迅速。)4.用5ml冰冷的0.1mol/LCaCl2轻轻悬浮细胞（将加样枪设定在500μl，轻吹细胞，有的书说：轻轻旋转，切勿剧烈振荡或以移液枪头吹打，约需2min），冰上放置15~30min（这步非常重要）。5.0~4℃，4000rpm离心10min，弃去上清，加入1ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后即制成了感受态细胞悬液。6.以上制备好的感受态细胞悬液可在冰上放置，24h内直接用于转化实验，也可加入等体积的30%灭菌甘油，混匀后，分装于0.5mlEP管中，每管含100μl感受态细胞悬液，置于-70℃下保存半年至一年。7.取100μl摇匀后的感受态细胞悬液（如果是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入质粒DNA溶液2μl（含量不超过50ng，体积不超过10μl）。8.轻轻摇匀后，冰上放置30min后，于42℃水浴中保温90s（期间要不断摇晃管子），然后迅速在冰上冷却3~5min。9.向EP管内加入100μlLB液体培养基，则总体积为0.2ml。混匀，于37℃水浴中温浴45min（欲获得更高的转化率，此步也可温和摇动培养），使受体菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。10.将适当体积（每个90mm的平板最多200μl，一般加100μl）转化后的感受态细胞均匀涂布到含相应抗生素的LB平板上。将平板置于室温直至液体被吸收。11.倒置平板，37℃培养。12~16h后即可长出转化克隆。