杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)

杆状病毒表达系统疫苗实验体液免疫与细胞免疫的检测&杆状病毒表达系统昆虫细胞的培养重组pFastBac质粒的构建重组Bacmid的产生与鉴定获得重组杆状病毒蛋白表达&病毒扩大OverviewBac-to-BacBaculovirusExpressionSystem能快速并有效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid+辅助质粒Bac-to-Bac表达系统的组成和工作原理Bac-to-Bac表达系统的组成和工作原理ExpermiantaloutlineInsectCellLines：Sf9orSf21cells——主要用于转染，空斑实验和滴度测定HighFive™cellsorMimic™Sf9cells——转染效率低，主要用于蛋白表达Grace'sInsectMediumwithL-glutamineandsupplementedwith（pH6.5）：3330mg/Llactalbuminhydrolysate3330mg/Lyeastolate350mg/LNaHCO310%heat-inactivatedfetalbovineserum昆虫细胞的培养Atmosphere：air,100%pipettingacrossthemonolayerscrapingcellscrapershittingtheflaskagainstthepalmofyourhandTemperature：27.0—28.0℃Subculturing：Preservation：90%serum,10%DMSO严格程序降温，-80℃过夜后转移液氮保存。昆虫细胞的培养重组pFastBac质粒的构建选择合适的载体重组Bacmid的产生重组Bacmid的鉴定PCR法:pUC/M13ForwardandReverseprimer或者pUC/M13ForwardorReverseprimerandaprimerthathybridizeswithinyourinsertBacmidDNA≥135kb获得重组杆状病毒——转染Sf9cells1.小提好的BacmidDNA，置4℃不超过1周2.转染试剂：Cellfectin®ⅡReagent3.转染后细胞的形态变化细胞变大增殖明显变慢或不增殖裂解脱落融合(VSV/G)或4.收毒，短期内4℃避光保存，长期保存分装后置-80℃病毒扩增&蛋白表达扩增病毒：接毒量为0.05—0.1MOI一般情况下，P1代毒滴度大概为1×106—1×107PFU/ml，P2代毒滴度1×107—1×108PFU/ml比如：P1代毒滴度为5×106PFU/ml，T75细胞瓶的细胞量2×107cells，那么蛋白表达：接毒量为1—5MOI杆状病毒滴度测定两种病毒滴度测定方法的比较：空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectiousunitsperml,orIFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法（PFU/ml）更短。BacPAK™RapidTiterKit本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数的换算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。注意事项：1.细胞铺板5×106cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染色，保证细胞活力≥95%。2.病毒稀释要准，不同浓度之间换枪头，是确保不同稀释度孔斑点成10倍关系的关键。3.整个过程中，轻轻洗板，避免细胞脱落过多。4.实验完毕3h后数斑，效果更佳。5.结果判定：疫苗免疫动物后免疫效力评价体液免疫检测ELISA抗体中和抗体细胞免疫检测细胞因子mRNA水平检测—qPCR细胞因子蛋白质水平检测—ELISA淋巴增殖实验—MTT法ELISA抗体1.制备良好的抗原包被ELISA板—纯化的蛋白或病毒3.设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的OD值先减掉背景值，再计算比值和滴度。（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。（2）酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，包被液PH大于蛋白PI，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提高包被效率。每次包被板子条件一致，4℃16-18h。2.血清样品不溶血，防止干扰结果。方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。微量中和实验技术中和抗体中和实验原理分类固定病毒—稀释血清法固定血清—稀释病毒法（用的很少）用途疾病诊断病毒分离株的鉴定不同病毒株的抗原关系研究疫苗免疫原性的评免疫血清的质量评价测定实验动物血清中是否存在抗体材料1.病毒（1）冻存的病毒不能重复使用（2）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定进行病毒定量2.血清样品（1）血清样品分装冻存于-20℃，一般不要反复冻融3次以上。（2）血清样品不溶血，不长期冻存，以减少对细胞的毒性。（3）需要有阳性和阴性对照血清，实验前需56℃灭活30分钟。3.细胞和细胞培养试剂（1）对数生长期细胞（2）DMEM/血清/胰酶/抗生素固定病毒—稀释血清法将不同稀释度的血清与固定量的病（200TCID50、EID50或LD50）混合，适当的条件下感作一定时间以后，再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价(PD50)。将96孔细胞培养板放入37℃5%CO2培养箱中作用45min—60min。感作完成后每孔加入100µl细胞悬液，继续置37℃5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察4-5天。结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。距离比例=(高于50%的保护率-50%)/(高于50%的保护率-低于50%的保护率)=(66.7-50)/(66.7-16.7)=0.33PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20即1:20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞不出现CPE中和效价(PD50)的计算：lgPD50=高于50%保护率的血清稀释度的对数+距离比例×稀释度对数的差=-1.2+0.33×(-0.3)=-1.299固定血清—稀释病毒法在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID50、EID50或LD50，然后计算中和指数。注意事项：1.待检血清需56℃灭活30分钟。2.需重复测定抗体时，血清应分装后冻存，以免反复冻融。3.细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化，细胞活力≥95%。4.牛血清有中和病毒感染力的作用，实验过程中切勿将细胞培养液与病毒稀释液混淆使用。5.病毒与抗血清混合，常规采用37℃作用1小时。但针对不同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。6.每份血清做3个生物学重复。细胞免疫的检测首先要完成淋巴的分离和体外刺激包括脾淋巴细胞/外周血单核细胞的分离脾细胞的分离：2.将脾脏转入匀浆器中，加少量不完全1640，轻轻研磨。1.处死的小鼠经消毒后，放置于泡沫板右侧卧固定，剪开左侧背腹交界处皮肤，分三套镊子/剪刀无菌取脾脏3.静置，吸上清液入15ml离心管中，1000rpm×10min。4.弃上清，加入5ml的8.3g/lNH4Cl，静止5min(去除红细胞)，1000rpm×10min。5.弃上清，用不完全RPMI-1640洗涤，1000rpm×10min。6.细胞计数，台盼蓝染色，要求细胞活性应在95%以上。7.调整浓度为4×106cells/ml。外周血单核细胞的分离：细胞因子的定量PCR检测：（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（basedoninvitrodose-responsestudies），然后将浓度为4×106cells/ml的细胞悬液加至各孔内，每孔1ml。（2）置37℃，5%CO2温箱中培养20h，提取细胞总RNA并测定RNA浓度和纯度。（3）取0.5µgRNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。（4）定量PCR：Primer-Forward（IFN-γ/IL-4/β-actin）1µl（10µM）Primer-Reverse（IFN-γ/IL-4/β-actin）1µl（10µM）2×SYBRGreenReal-timePCRMasterMix12.5µlcDNA1µlROX0.05µlH2O9.45µl总25µL细胞因子的ELISA检测：（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（basedoninvitrodose-responsestudies），然后将浓度为4×106cells/ml的细胞悬液加至各孔内，每孔1ml。（2）置37℃，5%CO2温箱中培养72h后，收取细胞上清。（3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不同），严格按要求操作。标准曲线是判定实验的质量。细胞免疫检测注意事项：1.分离淋巴细胞的速度要快，避免体外长时间操作导致过多淋巴的活性降低和死亡。2.台盼蓝染色计数，保证实验组间有效细胞的数量相同。3.准备免疫原性较好的刺激，并通过预实验确定最佳刺激剂量。4.RNA提取时，不丢弃24孔板中淋巴细胞上清。5.严格按照细胞因子ELISA试剂盒操作步骤实验。谢谢