CTC检测技术

1GDS_70000_Title_v11外周血循环肿瘤细胞检测技术第三军医大学西南医院张晓丽2GDS_70000_Title_v12ASCOAnnualReport：2015临床肿瘤学进展液体活检引领未来十年肿瘤治疗液体活检样本之CTCs3GDS_70000_Title_v13CTCs的概念1896年Ashworth患者外周血中发现与原发肿瘤细胞体积和形态相似的细胞目前CTCs定义为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞在肿瘤转移灶形成前即可在外周血中检测到循环肿瘤细胞AshworthTR.AustMedJ,1869,14:146-147AllardWJ,etal.ClinCancerRes,2004,10:6897-69044GDS_70000_Title_v14循环肿瘤细胞的特性Wuetal.ClinChemLabMed2013,10.1515Allard,W.J.etal.ClinCancerRes2004;10:6897-69045GDS_70000_Title_v15循环肿瘤细胞的特性Mego,M,Nat.Rev.Clin.Oncol.2010细胞表面抗原标志物表达差异携带不同的分子信息转移潜力差异异质性6GDS_70000_Title_v16循环肿瘤细胞的特性Bednarz-Knoll,etal.CancerMetastasisRev(2012)31:673–687CTCs可以是间质型、上皮型、上皮间质混合型、成团的CTCs(CTM)7GDS_70000_Title_v17BreastCancer：NEnglJMed351:781-791,2004ProstateCancer:LancetOncol10:233-239,2009ColorectalCancer:JClinOncol26:3213-3221,2008CTC对于无进展生存期与总生存期的有效预测CTCs检测的临床可行性8GDS_70000_Title_v18如何检测CTCs？•CTCs的富集：如何获取CTCs？每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而10mL血液中含有的白细胞约有1亿个，红细胞有500亿个。※从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞•CTCs的鉴定：如何鉴定所获细胞为CTCs？※将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等区分开来循环肿瘤细胞的检测9GDS_70000_Title_v19CTCs检测技术HarouakaR,KangZ,ZhengSY,etal.PharmacolTher.2014Feb;141(2):209-21.10GDS_70000_Title_v110原理技术产品免疫捕获法(根据细胞表面标志物)阳性富集法：•CellsearchTM系统•CTC芯片（CTC-chip）•MACS®CellSeparation阴性筛选法：•EasySep•Cyttel过滤法(根据细胞大小)ISET膜过滤密度梯度离心（根据细胞密度）OncoQuick分离体系流式细胞检测法无CTCs的检测方法及代表技术产品11GDS_70000_Title_v111免疫捕获法——磁珠分选原理：将特异性抗原包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠再与靶细胞上抗抗原结合成“靶细胞—抗原抗体—磁珠”复合物，在磁场作用下向一定方向移动，从而富集靶细胞.分选策略•阳性富集：使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠，细胞与磁珠结合后直接在磁场中被分离出来。•负性筛选：通过去除无关细胞使目的细胞得以纯化12GDS_70000_Title_v112阳性富集CellsearchTM系统/CTC芯片（CTC-chip）/MACS®CellSeparation磁性细胞分选系统原理：采用抗EpCAM（CD326）结合免疫磁珠捕获EpCAM阳性CTCs特点：捕获的CTCs纯度较高能够捕获到血液中上皮型、上皮间质混合型的CTCs无法捕获到间质型CTCs（EpCAM阴性）13GDS_70000_Title_v113magnetAnti-EpCAMCoatedferrofluids7.5mlAnti-CK(epithelialcells)Anti-CD45(WBCs)DAPI(viablecells)Automatedfluorescencedetectionsystemmagnet使用抗EpCAM抗体抗体包被磁微粒，使其与肿瘤细胞结合，在特定磁场作用下达到分离CTC的目的。阳性富集-CellsearchTMCTCWBC14GDS_70000_Title_v114CellsearchTMCTCs鉴定CTCs的判定：DAPI（细胞核）阳性、角蛋白CKs阳性、CD45阴性15GDS_70000_Title_v115NormalBenignBaseline3-5WeeksBaseline3-5WeeksBaseline2-5Weeks012345678910#ofCasesN(%)1CTCN(%)2CTCN(%)3CTCN(%)4CTCN(%)5CTC29510(3%)0(0%)0(0%)0(0%)0(0%)25519(7%)2(1%)2(1%)1(0%)1(0%)177125(71%)108(61%)102(58%)94(53%)88(50%)13273(55%)53(40%)47(36%)42(32%)40(30%)413196(47%)138(33%)108(26%)90(22%)75(18%)33489(27%)48(14%)41(12%)34(10%)26(8%)11611111612112613113126312123121831224312219170(78%)152(69%)139(63%)129(59%)125(58%)203123(61%)106(52%)93(46%)86(42%)80(39%)MCRCPatientsMBCPatientsAIPCPatientsHealthyControlsBenignDiseasesBaseline3-5WeeksBaseline3-5WeeksBaseline2-5WeeksCTCper7.5mLofBloodCellsearch在各癌种中的检出率16GDS_70000_Title_v116•芯片的表层排布了78000个包被抗EpCAM抗体的微位点•血液样本流经芯片时，抗体与肿瘤细胞结合粘附在芯片上阳性富集-CTCs-Chip17GDS_70000_Title_v117原理：•联合上皮细胞标志及肿瘤特异性标志通过免疫磁珠分选特异性肿瘤的CTCs•联合抗MUC1和EpCAM抗体检测乳腺癌和直肠癌•通过RT-PCR扩增肿瘤标志物来鉴定CTCs•特点：•较单一使用EpCAM抗体更特异•不适用于EpCAM和CK阴性或弱化的CTCs•PCR鉴定敏感性高，但易造成假阳性阳性富集-AdnaTest检测系统18GDS_70000_Title_v118免疫捕获技术缺陷（一代技术）技术应用分析参考文献CTCs分离具有特定表面抗原分离效率高，纯度高JTranslMed.2012,10:138.ClinCancerRes.2011,17(2):337-45.间质细胞表型CTC间质细胞表型CTC不表达上皮细胞标志物（如EpCAM）BreastCancerRes.2008,10(4):R69.BMCCancer.2012,12:178.CTMCTM多为间质细胞表型CTM体积大导致捕获效率低操作步骤多易使CTM人为分散AmJPathol.2011,178(3):989-96.Cancers.2010,2,1236-1250.血小板包裹CTC抗体与抗原结合受血小板包裹阻隔CancerCell.2011,20(5):576-90.CTCs分型只分离获得特定类别的CTC，因此无法分型CTCs分析只能分析特定类别的CTC19GDS_70000_Title_v119阴性富集Cyttel/Cytelligen检测系统•原理:利用CD45磁珠抗体吸附白细胞，在磁场作用下去除白细胞，CTCs被富集沉淀•特点：可检出EpCAM、CK阴性的间质型CTCs样本处理步骤多，CTCs易丢失20GDS_70000_Title_v120阴性筛选法--Cyttel步骤较多，CTCs容易丢失鉴定不稳定•判定标准：DAPI阳性、CD45阴性，8号染色体扩增；•特异性不足21GDS_70000_Title_v121基于细胞大小过滤原理：根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离CTC代表技术：滤膜滤法分离上皮源肿瘤细胞（ISET）方法：将全血经过带小孔8μm的聚碳酸酯膜的过滤，即可除去白细胞富集得到CTCs.特点：•细胞完整性好；•可完全分离上皮型、间质型CTCs；•可检出循环肿瘤拴子；•局限：不宜检出细胞直径小于8μm的肿瘤•如神经内分泌瘤HepG2cellsstainedwithanti-KL1滤膜法22GDS_70000_Title_v122密度梯度离心原理：根据肿瘤细胞与白细胞密度不同，通过梯度离心分离CTCsOncoQuick分离体系方法：密度梯度离心后，白细胞通过多孔滤膜被滤除，而CTCs被富集在介质层中，洗脱后得到CTCs.特点：可分离CK阳性和阴性细胞局限性：•CTCs迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞层而丢失；•CTCs微栓子可能沉入红细胞层而丢失；•与肿瘤细胞特性、离心时间和温度等有关；•用血量多15-30ml23GDS_70000_Title_v123流式细胞术原理：•根据白细胞表达CD45抗原、CK阳性CTCs表达EpCAM，采用不同荧光素标记的抗CD45和抗EpCAM，通过流式细胞术分析和分选CK阳性细胞的CTC（CD45-EpCAM+）可在检测的同时进行细胞形态、DNA倍数分析敏感性较低，需要的血液样本量大缺乏规范的临床操作方法24GDS_70000_Title_v124技术优势局限性阳性率样本量参考文献CellsearchTM特异性好、重复性好、可自动化不能分型、漏检转移侵袭能力较强的间质型CTCs及CTM71%（MBC）47%（MCRC）78%（AIPC）7.5mLNEnglJMed.2004，351:781-91.JClinOncol.2008,26:3213-3221.ClinCancerRes.2008,14:6302-6309.CTCs-chip(HB-chip)特异性好、灵敏度高、HB芯片可富集到CTM不能分型、漏检转移侵袭能力较强的间质型CTCs93%(MPC)0.9-5mlPNAS.2010,107:18392–18397Cyttel可检测出EpCAM、CK阴性的CTC、未对CTC进行任何标记不能分型、鉴定不稳定、鉴定时易发生CTCs丢失64.5%(NSCLC)5mL周小昀,癌症进展.2010,8(5):484-490.ISET膜过滤CTC丢失少、适用于CK阴性肿瘤、适用于形态学、免疫学和基因特异性分析不适合小神经内分泌肿瘤细胞、特异性低、残留大的白细胞80%（BC）1-15mlClinCancerRes.2010,16(20):5011–5018.常见CTCs一代检测技术的比较25GDS_70000_Title_v125临床实践亟需新技术实现CTCs分离、分型、分析26GDS_70000_Title_v12627GDS_70000_Title_v127先分离后鉴定，采用上皮+间质标志物进行鉴定，不同表型的CTC均能检出。技术原理28GDS_70000_Title_v128CanPatrolTM-CTCs高效捕获癌种例数阳性例数阳性率中位值均值±SDCTCs范围非小细胞肺癌33028687%49±190-240肝癌51139577%48±110-83结直肠癌30224079%36±90-76乳腺癌21818484%48±110-120胃癌14812886%58±90-46鼻咽癌1259677%24±60-33宫颈癌1574172%47±1