DNA复制,修复和重组

第二章DNA的复制，修复和重组1.DNA的代谢过程包括复制，修复和重组2.大肠杆菌遗传图整个图分为100分钟，每分钟约40，000bp。基因名称基本反映基因的功能，用3个斜体字母表示，如mut，诱变相关基因；pol，DNA多聚酶基因；rec，重组相关基因等等。作为基因产物的蛋白质名称则用第一个字母为大写的正体字，如“RecA蛋白”。第一节DNA复制一.关于模板的概念（template）模板分子的概念产生于DNA双螺旋结构建立之前，能指导子代生物大分子按特定顺序合成的母链称模板。二.DNA复制的基本规律a.DNA复制是半保留的；b.DNA复制在一个原点（orgin）开始，双向进行；DNA分子复制的起点称原点，大肠杆菌的复制原点称OriC，终点区是ter。DNA复制点呈分叉状，分叉状复制区域称复制叉。c.DNA复制是半不连续的；I.冈崎片断（Okazakifragments）；II.复制叉上的前导链（leadingstrand）和滞后链（laggingstrand）；三.依赖于DNA的DNA聚合酶1.E.coliDNApolymeraseI的发现，ArthurKornberg，1955，单肽链，Mr＝103,000。2.DNA聚合酶酶促反应机制(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi引物任意脱核延长一个焦磷酸苷三磷酸核苷酸残基DNA聚合反应的关键是生长链的末端核苷酸的游离3’羟基对下一个参加聚合反应的脱氧核苷三磷酸中的α-磷原子发动亲核进攻，建立酯键，释放出焦磷酸。DNA聚合酶催化反应的基本规律：所有DNA聚合酶都需要模板；所有DNA聚合酶都需要引物（primer）；引物：互补于模板链的一个寡核苷酸片断，它带有一个游离的3’－OH，以便建立新的磷酸二酯键。所有的核酸链聚合反应都从5‘——3’方向进行。四.DNA多聚化的热力学DNA聚合酶(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+Ppippi焦磷酸酶2pi＋2KJ/mol－30KJ/mol－28KJ/molΔG0’＝-28KJ/mol但由DNA聚合酶催化的上述反应在无焦磷酸酶参与下仍能继续进行。聚合反应导致多重弱相互作用的形成，它们释放的能量促进多聚化反应：C－H约100KJ/mol；OH…O＝C约4-5KJ/mol；vanderWaal’s约1KJ/mol。五.DNA聚合酶催化DNA聚合反应的精确性E.coli中的实际错误率10-9－10-10；E.coli基因组4.7×106bp；1.复制的碱基配对可以达到10-4－10-5的错误率。这错误率相当于碱基上功能基团的互变异构反应的动力学常数。2.DNA多聚酶3‘－5’外切酶活性对碱基配对的校对作用（proofreading），可以提高精度102－103倍，距离细胞内DNA复制精度还差102。校对作用不是合成的逆反应，两种活性是独立的。以上两个过程复制和校对，都依赖碱基配对中的非共价相互作用，这是提高信息分子复制高保真度的根本方法。六.大肠杆菌有多种DNA聚合酶1.DNApolymeraseI的特性5’－3’聚合酶活性；3’－5’外切酶活性；5’－3’外切酶活性。DNA合成速度不及复制叉移动速度的1/20，16-20nt/s；连续性太低；遗传学证据证明polA－细胞也能存活；2.II型DNA聚合酶和III型DNA聚合酶II型参加SOS修复；III型是主要的DNA复制酶；3.E.coliI型DNA聚合酶的两个主要应用a.“Nicktranslation”（切口移位技术），I型DNA聚合酶具有以双链DNA的一个切口开始，用5‘－3’的外切酶活性降解这条旧链，并合成一条新链代替旧链，用这种技术在试管内把放射性核苷酸导入DNA，用于探针放射性的标记。b.多聚酶链式反应（PCR，polymerasechainreaction），在试管内扩增一个特定基因组片断的一个方法。4.E.coli三种DNA聚合酶的比较七.复制复合物（replisome，复制体）复制体含有20种以上的蛋白质和酶类，如DNA解螺旋酶（helicases），ssb（单链结合蛋白，singlestrandbindingprotein），primase（引物酶），DNApolymeraseIII，DNApolymeraseI，DNAligase（DNA连接酶），DNA拓扑酶。八.大肠杆菌染色体DNA复制的三个阶段生物大分子的合成都可以分成三个阶段：起始（initiation），延长（elongation），终止（termination）。1.DNA合成的起始a.大肠杆菌复制原点，OriCConsensussequence（交感顺序）：一个理想化了的DNA顺序，这种顺序中的每个位置上的碱基代表着被比较的同功能的许多顺序中最常出现的碱基。b.起始复合物（或预引复合物，preprimingcomplex）DnaA蛋白(20copies，结合于9bp序列，以打开串联13bp序列）；DnaB（helicase）DNA解螺旋；DnaC蛋白促进DnaB蛋白的结合；HU类组蛋白，刺激起始；DnaG（primase）引物酶，合成RNA物；SSB单链DNA结合蛋白；RNApolymerase促进DnaA的活性；DNATopoisomeraseII释放由DNA解螺旋产生的扭转力（torsinalstrain）；c.复制起始的调节2.复制中DNA链的延长a.前导链的延长两条链合成共同需要的酶：DNAhelicase，DNATopoisomerase，SSB，DNApolymeraseIII，primase。b.滞后链的延长引物体（primosome）含有DnaB，DnaADnaG等七种蛋白，引物体间隔性地迫使引物酶合成含10-60核苷酸残基长地RNA引物，DNApolymeraseIII加接脱氧核苷图12-9图12-10酸，DNApolymeraseI除去RNA引物，并合成DNA链代替，所留下的nick（切口）由DNA连接酶连接。c.DNA连接酶连接具有5’－磷酸和3’－OH的切口形成磷酸二酯键，连接酶以NAD或ATP为能源。3.终止在原核细胞中，两个方向相反的复制叉在染色体对相遇时复制的终止过程开始。八.真核细胞DNA的复制1.真核细胞染色体上有许多复制原点（起点），称自体复制顺序（autonomouslyreplicatingsequences，ARS），长约150bp，在yeast中，400ARS，in17chr。2.复制叉移动速度仅及细菌的1/10。3.有多个DNA聚合酶（α,ε,δ等）。第二节DNA修复（repair）一.关于突变的一些概念1.天然突变和诱变天然突变：如碱基的互变异构，宇宙线造成的突变。天然突变率称突变的本底水平（background）。诱导突变（inducedmutation）：补加诱变剂诱发的突变。诱变剂：引起突变的任何物理因子或化学因子称诱变剂或诱变因子。一些生物学过程也引起突变，如病毒的感染（在染色体上的整合等）。2.突变的分类点突变：用一个碱基对替换另一个碱基对的突变。插入（insertion）和缺失（deletion）：插入和缺失都可以造成基因的框移突变（frameshiftmutation）。无意义突变（nonsensemutation）：有意义密码改变成终止密码的突变。3.点突变的渗漏性a.沉默突变（silentmutation）突变不改变氨基酸残基，CUX对应Leu，CCX对应Pro；改变氨基酸残基但不影响基因产物的活性，如PheTyr，LeuIle；正向突变灭活一个基因的突变称正向突变（forwardmutation）。突变的回复能克服原始突变造成的影响的第二次突变称回复突变（reversionmutation）真回复truereversion第二点回复：回复突变发生在同一基因内的第二个位点。4.突变的抑制作用（suppression）a.基因内抑制（或基因内回复，intragenicreversion），指一个补偿突变恢复了原突变蛋白的活性构象；或在一个框移突变之后恢复正确的读码框架。b.突变的基因间回复（或基因间的抑制）第二个基因的突变排除或抑制了第一个基因突变的影响，如抑制子tRNA抑制无意义突变和错义突变。二.肿瘤发生和Ames检测DNA核苷酸顺序的永久性改变称为突变，突变的积累导致动物肿瘤的发生。一般的说诱变剂是致癌物。Ames检测法检出致癌物：利用一株沙门氏杆菌组氨酸合成酶缺陷株。诱变剂（致癌物）可导致基因突变的回复，使之成为野生型，这原理可用检出诱变剂。三.细胞中的DNA修复系统细胞有多个DNA修复系统，为遗传信息的完整性不惜代价。DNA修复的主要根据是以正确的互补链修复损伤的或错误的链。1.错配修复（mismatchrepair）a.DNA复制后错配碱基在模板链指导下的修复过程称错配修复，可提高复制精确率102-103倍；b.区分模板链和新合成链依靠识别亲本链中GATC序列中的甲基化标签（tag）；c.Dam甲基化酶甲基化DNA（A碱基的N6甲基化）；d.错配修复所需的酶类Dam甲基化酶；MutH，MutL，MutS蛋白；DNAhelicaseII；SSB；DNApolymerasIII；exonucleaseI；外切酶VII；RecJ核酸酶；DNAligase。e.修复过程图解2.碱基的切割修复主要酶类：核酸糖基化酶（glycosylase），AP内切核酸酶，DNApolymeraseI，DNAligase核酸糖基化酶识别损伤碱基，切割损伤碱基产生AP位点，由AP内切核酸酶切割AP位点的磷酸二酯键。3.核苷酸切割修复由uvrA，uvrB，uvrC编码的“ABC切割核酸酶”，ABCexcinuclease切去碱基光促合成产物，切去损伤点上游8nt，下游4-5nt。4.直接修复（directrepair）a.光复活修复DNA光解酶（photolyase）b.O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶去甲基化5.差错倾向修复（error-pronerepair）SOS反应a.SOS反应当细胞DNA受到大量的严重的损伤时，诱发细胞的应急反应（SOSrespone）。此时细胞诱导产生大量应急反应所需的蛋白和酶。这种反应使细胞分裂受到抑制，溶源状态的噬菌体被诱导进入溶菌周期，正常的DNA复制停止。同时诱发产生许多正常的DNA修复酶和特殊的DNA修复－差错倾向修复所需的酶类。b.DNApolymeraseV和translesionreplicationDNA聚合酶V能复制DNA链的损伤位点，造成高突变率。第三节细胞内DNA的遗传重组（Geneticrecombination，或称基因重排Generearrangement）一.普通重组（Generalrecombination）和位点特异性重组（site-specificrecombination）1.普通重组（依赖同源顺序的重组）亲本的双链DNA在同源顺序区域并排（联会），通过互换同源DNA片断形成新组合的DNA分子，这个过程称为普通遗传重组。2.位点特异重组无需同源顺序的遗传重组，包括：a.外来DNA在特殊染色体特殊位点的整合，如HIV，λ；b.基因转座（transposition）转座是基因或某DNA顺序从一个染色体转移到另一染色体或从同一染色体的一个座位转移到另一座位的遗传学事件。3.遗传重组的生物学意义a.普通重组在DNA损伤的修复中起重要作用；b.重组扩大生物界遗传多样性，产生新的基因组合，对进化有重要意义；c.调节基因表达，一个基因的沉默或激活可因它在染色体上的位置和取向的改变而改变，如酵母性别转换，菌毛基因类型的改变（phasevariation）；d.遗传重组使抗体多样化。二.普通遗传重组机制1.依赖于同源顺序遗传重组的细胞学证据：染色体的交叉互换2.普通重组的Holliday模型（RobinHolliday，1964）a.同源DNA（homologousduplexes）并排在一起（“联会”）；b.内切酶切割两并列双链中各一条链；c.交叉