DNA重组技的基本工具

＋﹦定向基因改造设想设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。专题1基因工程：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物,定向地改造生物的遗传性状。原理：操作水平：结果：目的基因供体细胞受体细胞基因重组DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。(细菌等微生物)（一）基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达请你回答：转基因抗虫棉抗虫棉普通棉•基因工程培育抗虫棉的简要过程：（一）基因工程的概念普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)重组DNA导入形成•解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？1．１DNA重组技术的基本工具DNA重组技术的基本工具关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：分子手术刀—分子缝合针—分子运输车—限制性内切酶DNA连接酶运载体一、“分子手术刀”——人会被细菌入侵而得病，细菌会被其他的生物入侵吗？人靠什么来防御入侵？那么细菌呢？限制性核酸内切酶1、来源：原核生物（细菌或霉菌）中分离纯化出来的一种酶。2、种类：4000种为什么不会剪切细菌本身的DNA？在长期进化过程中，含有哪种限制酶，就不具备相应的序列；或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别的序列中，使限制酶不能将其断开。限制酶的作用是什么？EcoRⅠSmaⅠ识别：（6个核苷酸，4、5或8）DNA分子的某种特定的核苷酸序列AATTGCCTTAAG断开：磷酸二酯键断开后的末端是怎样的？大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制酶什么叫黏性末端？限制酶被限制酶在识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。什么叫平末端？当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。ＥcoRI限制酶SmaI限制酶识别序列－ＣＣＣＧＧＧ－切割位点Ｇ和Ａ之间Ｃ和Ｇ之间未端类型平末端粘性末端－ＣＴＴＡＡＧ－－ＧＧＧＣＣＣ－－ＧＡＡＴＴＣ－3、作用：4、结果：形成两种末端粘性末端平末端特异性识别：DNA分子的某种特定的核苷酸序列（6个核苷酸，4、5或8）断开：磷酸二酯键•要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？（二）基因操作的工具要切两个切口，产生四个黏性末端。•如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。二、“分子缝合针”——DNA连接酶与DNA聚合酶有何区别？DNA连接酶以DNA的一条链为模板合成DNA双链DNAAGTACAAATG游离的脱氧核糖核苷酸DNA聚合酶AGTACAAATGDNA聚合酶DNA聚合酶AGTACAAATGTTDNA聚合酶AGTACAAATGTTADNA聚合酶AGTACAAATGGTTADNA聚合酶AGTACAAATGGTTATDNA聚合酶AGTACAAATGGTTATTDNA聚合酶AGTACAAATGGTTATTADNA聚合酶AGTACAAATGGTTATTATDNA聚合酶AGTACAAATGGTTATTATCDNA聚合酶AGTACAAATGGTTATTATCDNADNA聚合酶具有连接单链DNA的本领DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，是把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子才能形成。DNA连接酶只可以连接双链DNA1、分类：大肠杆菌：T4噬菌体：E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶作用：作用：只能将粘性末端之间连接既可以“缝合”粘性末端，又可以“缝合”平末端（效率低）。运载体将外源基因送入受体细胞。三、分子运输车—1.作用：2.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。天然的质粒、噬菌体和动植物病毒是否都可以直接用做运载体？1.如果从霍乱弧菌中分离出来的质粒来做载体，请问谁敢用它来做受体的载体？运载体DNA必需是可靠的2.运载体DNA要携带目的基因，如何携带？运载体DNA必需有一个或多个限制酶切点且切点必须在质粒本身需要的基因片段之外。3.运载体DNA要携带目的基因进入后如何表达？自我复制（整合到受体DNA上）4.如何确认目的基因进入受体细胞？并进行筛选？带有标记基因3.条件：必需是可靠的必需有一个或多个限制酶切点自我复制（整合到受体DNA上）带有标记基因运载体DNA大小适合，便于提取和操作目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。㈡基因操作的基本步骤１、提取目的基因——将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶2、目的基因与运载体结合用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。3、将目的基因导入受体细胞并使之扩增导入扩增要让目的基因表达，必须将它导入受体细胞并进行扩增。为获得目的基因的表达产物时，通常以大肠杆菌等无害易得的细菌为受体。为改进某种生物时，将欲改进的生物细胞为受体。为使重组的DNA分子更容易进入受体细胞，通常还要用一些物质对受体细胞进行处理，使受体细胞具有更大的通透性。4、目的基因的检测和表达前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。质粒的特点1.细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；2.质粒的存在对宿主细胞无影响；3.质粒的复制只能在宿主细胞内完成。1.以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键C练习2.有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种B、重组DNA的形成在细胞内完成C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、质粒都可作为运载体BD练习3.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）Ａ．同种限制酶B.两种限制酶Ｃ．同种连接酶D.两种连接酶Ａ注意：要用同一种限制酶切取目的基因和运载体，并用DNA连接酶连接。练习4.不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD练习双基练习：一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外____和____等技术,赋予生物以心得遗传特性,创造出符合人们的需要的新的____和____.又叫做DNA的重组技术.二、DNA重组技术的基本工具1.限制性核酸内切酶-----”分子手术刀”(1)主要来源:从____生物中分离出来的.(2)特点:能够识别DNA特定的核苷酸序列,切开两个____之间的_____.(3)DNA末端:限制酶切割DNA产生的DNA末端有两种形式:______和_______.2.DNA连接酶----”分子缝合针”(1)作用:将双链DNA____,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的______.(2)种类:①E.coliDNA连接酶:只能缝合DNA的_____②T4DNA连接酶:既可缝合DNA的_____,又可缝合双链DNA的_______.3.基因进入受体细胞的载体----”分子运输车”(1)载体的种类①质粒:是一种裸露的,结构简单,独立于细菌染色体之外,并能够自我_____能力的双链______DNA分子;②______的衍生物;③________.(2)载体的特点①能够在细胞内_______;②有一个或多个____切割位点,便于供源DNA的插入.③具有_____基因,供重组DNA的鉴定和选择.假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？如果不能分离会怎样？对受体细胞无害，易分离．