基础生物学实验六实验手册

襄樊学院化学工程与食品科学学院生物系基础生物学实验六实验手册目录一、植物DNA的提取2二、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段4三、聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段6四、DNA片段回收及与载体连接8五、大肠杆菌感受态细胞制备与转化10六、碱裂解法小量提取质粒及质粒酶切12七、细胞特异性染色15八、动物细胞的基本形态观察和细胞计数19九、细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察23十、线粒体和液泡的超活染色与观察26十一、聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合28十二、细胞骨架系统的显示与观察30十三、植物细胞的有丝分裂染色体标本制片及观察33十四、蚕豆根尖微核检测技术36一、植物DNA的提取【目的要求】学习提取和纯化高等植物总DNA的方法，理解其原理。【基本原理】通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。【实验用品】1、实验材料幼嫩叶子2、器材移液器，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心管，。3、药品2%CTAB抽提缓冲溶液:CTAB4gNaCl16.364g1MTris-HCl20ml(PH8.0)0.5MEDTA8ml，先用70mlddH2O溶解,再定容至200ml灭菌,冷却后0.2-1%2-巯基乙醇（400ul）3、24：1/氯仿:异戊醇4、RnaseA母液5、其它试剂：异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇。【方法步骤】1、取冷冻保存或新鲜的植物材料，液氮下研磨，然后转移到液氮预冷的1.5ml离心管中，加入500μlDNA提取缓冲液，65℃水浴1hr‘每隔15min上下颠倒一次；2、从水浴中取出后，冷却至室温，加入500μl24：1氯仿：异戊醇，上下轻柔颠倒混匀；3、12,500rpm离心5分钟，取上清，加入500μl24：1氯仿：异戊醇，上下轻柔颠倒混匀；4、如果中间层蛋白质过多，重复步骤2；5、12,500rpm离心5分钟，取上清，加入2.5倍体积的无水乙醇，冰箱冷藏沉淀30分钟；6、12,500rpm离心5分钟，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，12,500rpm收集沉淀；7、干燥沉淀，用50μl含有RnaseA的TE溶解沉淀；【实验结果】【实验报告】二、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段1【目的要求】学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术【基本原理】琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯化的重要实验手段。DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况下，单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，在紫外光照射下可发出波长590nm的红色荧光，DNA分子与EB形成荧光络合物后，其发射的荧光比原来要增强数十倍，常用来观察凝胶中DNA条带的位置。【实验用品】1、实验材料上次实验提取的DNA2、器材刻度量筒、玻璃棒、三角烧瓶、移液枪及枪头、微波炉或沸水浴、凝胶灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝胶样品梳、稳压稳流电泳仪、凝胶成像系统、电源等。3、药品琼脂糖凝胶(0.7～1.5%，琼脂糖粉末与1×TAE配成)，TAE(Tris-乙酸盐，EDTA)电泳缓冲液[50×浓缩贮存液：Tris碱242g；冰醋酸57.1mL；0.5mol/LEDTA(pH8.0)，100mL；加600mL、蒸馏水，剧烈搅拌，加蒸馏水至1000mL，]。溴化乙锭(EB)贮存液(10mg/mL)：在100mLH2O中加入1g溴化乙锭用磁力搅拌器搅拌几个小时，然后转至棕色瓶中，4℃贮存(溴化乙锭是强诱变剂，称量时需要戴手套和口罩，万一接触了溴化乙锭，立即用大量的水冲洗)。10×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、15%的Ficoll水溶液、0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0、1.0%SDS。【方法步骤】1、将琼脂糖电泳的磨具置一个水平台上。2、根据被分离DNA片段的大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉将其加入到盛有已定量电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中，用玻璃棒搅拌均匀后放入沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化。3、待凝胶稍微冷却后，将胶缓慢倒入模具中，胶厚度以3～5mm为宜。4、让凝胶溶液完全凝结，室温下30～45min，待胶略凝结时放入4℃冰箱可大大缩短凝结时间。小心拔出梳子，将凝胶安放到电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极(黑末端)。5、向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。6、取适量的DNA样品与10×加样缓冲液混合，然后用移液枪将样品加入样品孔内。7、加样完毕后，关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA应向阳极(红色插头)侧泳动。给予1～5V/cm的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。若电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡。8、电泳时间的选择取决于胶的长度、电压和DNA片段的大小。胶越长，电压越低，DNA片段越大，所需时间就越长。然而使用高压时，大的DNA片段的分辨率很低，电泳出的条带不清晰。9、当DNA样品在凝胶中迁移足够距离时，关上电源并取出样品放入事先配好的EB溶液中染色5～7min(EB见光分解，应置于暗室中)，在紫外分析仪上观察并可用数码相机进行拍摄。【实验结果】【实验报告】三、聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段【目的要求】掌握PCR实验的操作方法，并理解其原理。【基本原理】类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。【实验用品】1、实验材料第一次实验提取的DNA2、器材PCR仪、台式离心机、移液器、PCR管、凝胶灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝胶样品梳、稳压稳流电泳仪、凝胶成像系统、电源等。3、药品Taq酶、10x扩增缓冲液、dNTP、正向引物（10pmol/μl,溶于无菌水中，贮于-20℃）、反向引物（10pmol/μl,溶于无菌水中，贮于-20℃）、无菌水、50xTAE、EB、加样缓冲液。【方法步骤】1、在PCR管中加入适量缓冲液、模板DNA、dNTP,正向引物、反向引物和Taq酶，将上述物质混合均匀后，短暂离心收集于管底。2、设定PCR程序，把样品放入PCR仪进行扩增。3、扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。标准PCR反应体系___________________________________________________10XPCRbuffer5.0μl10mMdNTP1.0μl正向引物1.0μl反向引物1.0μl模板2.0μlTaqDNA聚合酶0.5μlddH2O39.5μl____________________________________________________总体积50μl【实验结果】【实验报告】四、DNA片段回收及与载体连接【目的要求】掌握DNA片段回收及与载体连接的方法及原理。【基本原理】质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA，快速，而且回收率高。其原理是融化含有目的片段的琼脂糖后，让DNA吸附在硅基质材料上，同时去除蛋白质、其他有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸等杂质。某些PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用TaqDNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。如果使用ddTTP，效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。【实验用品】1、实验材料上次实验的PCR产物。2、仪器台式高速离心机、低温水浴锅、水浴锅。3、药品琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、T-载体连接试剂盒、无水乙醇，无菌水。【方法步骤】1、紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。2、加入3倍体积的溶胶液（每100mg凝胶加BufferQG300μl），置50℃水浴10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100μl），混匀。3、将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上。13000rpm离心1min，弃去收集管中液体，将吸附柱重新放入收集管中。4、向吸附柱中加入700μlBuffer漂洗液，13000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。5、向吸附柱中加入500μl漂洗液，13,000rpm离心1min，倒掉废液。6、将离心吸附柱放回收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱开盖置于室温1-2min，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。7、将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl65-70℃预热的洗脱缓冲液，室温放置2min，13,000rpm离心2分钟收集DNA溶液。取5μl进行电泳检测。8、将回收产物按照T-载体连接试剂盒说明书与T-载体进行连接。【实验结果】【实验报告】五、大肠杆菌感受态细胞制备与转化【目的要求】掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理，熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。【基本原理】所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统（Restriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的外源DNA的切割，用符号R-M-表示。其基本原理是：细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42℃短时间的