蛋白质组学-质谱-iTRAQ

蛋白质组学与抗逆性一、蛋白质组学概念及发展二、蛋白质组研究方法三、蛋白质组学在非生物逆境中的应用主要内容1、概念？蛋白质组是动态的，作为基因组表达的产物随时间、地点、环境条件变化。蛋白质组与基因组区别基因组是静态的，一个有机体发生、发展、衰亡，不同细胞、组织基因组是基本稳定不变从mRNA表达水平并不能预测蛋白表达水平蛋白质合成、降解、加工、修饰调控过程，需要蛋白质组分析2、蛋白质组学发展历史1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白组研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility）。我国从1997年开始开展蛋白质组研究，是较早倡导和开展蛋白质组学的主要国家之一。2001年我国蛋白质组研究进入快速发展新阶段，设立了“973”和“863”项目2001年2月9日宣告成立国际人类蛋白组组织（HUPO）生物学问题：蛋白质表达变化翻译后修饰蛋白质-蛋白质互作3、蛋白质组学研究蛋白质组学研究的技术平台和生物信息学¾蛋白分离技术¾鉴定技术¾分析软件¾数据库其他研究内容研究方法蛋白质组学应用领域蛋白质组学应用ProteomicsbyPubMedProtemics44,733publications(2001--2012)缩写名/全名影响因子年文章投稿难易一审周期JPROTEOMERESPROTEOMICS5.1134.505493426较难较难较快平均2月JPROTEOMICS4.878301命中率约50%平均1月MOLCELLPROTEOMICS7.398265较难一般,3-6周BBA-PROTEINSPROTEOM3.635211较易平均2月PROTEOMCLINAPPL1.9757较易较慢,6-12周EXPERTREVPROTEOMIC3.68556一般较慢,6-12周CURRPROTEOMICS3.1796命中率约80%12周或约稿一、蛋白质组学概念及发展二、蛋白质组研究方法三、蛋白质组学在非生物逆境中的应用主要内容（一）经典蛋白质组学研究方法（二）蛋白质组学新方法（一）经典蛋白质组学研究路线1、样品处理通常采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行分析；也可以进行样品预分级，对不同组分蛋白进行研究：2、蛋白质分离技术凝胶分离技术：•双向凝胶电泳（2-DE）应用最广泛、最成熟•双向荧光差异电泳(DIGE)新型非凝胶电泳：•液相色谱法（LC）•毛细管电泳（CE）（1）双向凝胶电泳（2-DE）第一向：等电聚焦（IEF）根据蛋白质的电荷差异将蛋白质分离第一向：等电聚焦（IEF）第二向：SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质的分子量差异将蛋白质分离第二向：SDS-PAGE蛋白质染色考马斯亮蓝染色法、银染法、荧光染色法（Cy3，Cy5）考马斯亮蓝染色法银染法一次良好的2-DE分析显色方法灵敏度优点缺点考染200ng操作简便，价格低廉，便于后续鉴定灵敏性差，所需上样量大银染0.1ng灵敏性好，所需样品少操作复杂，不利于后续鉴定荧光1ng定量定性较好，便于后续鉴定仪器试剂昂贵染色比较（2）新型非凝胶电泳分离技术克服双向（2-D）电泳中难以分离鉴定的高分子量（100KD）、低分子量（10KD）、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋白进行有效分离，与质谱联用。蛋白质组分离方法的优、缺点类别优点缺点2-DE成本低，重复性较好只能分析可溶性蛋白，操作繁琐，工作量大，需要蛋白样品量较大HPLC2D-LC可分离样品分子大小差异较大的蛋白质、低丰度蛋白质及疏水性蛋白质，易与质谱连接，高灵敏度，分析速度快，自动化程度高成本高3、蛋白质鉴定技术图像扫描分析蛋白点挖取胶内蛋白质酶解自动质谱点样质谱分析（1）（2）（3）蛋白质鉴定过程（1）凝胶图像处理分析软件蛋白点挖取胶内蛋白质酶解（2）差异蛋白酶切原理（3）质谱分析质谱技术发展过程质谱分类•一级质谱(肽质量指纹图谱)•二级质谱一级质谱电喷射离子井飞行时间质谱（ESI－TOFMS）基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI－TOFMS）电喷射离子井飞行时间质谱（ESI－TOFMS）基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI－TOFMS）肽质量指纹图谱（peptidemassfingerprinting，PMF）离子化的肽段经质谱仪，因相对分子质量差异而被分离，产生含有不同峰值的肽质量指纹图谱。通过PMF与已知数据库（NCBI、EBI）理论期望蛋白酶肽段比较，根据匹配程度得分推测理论蛋白。通过第一级质谱检测后，选择特定的肽段，与惰性气体（如氮气）碰撞，对肽段进一步离解，检测氨基酸序列。二级质谱串联质谱或MS／MS谱，将2个一级质谱连接在一起构成，可以更精确、更灵敏地分析蛋白样品。通过肽指纹图谱与数据库搜寻匹配（4）鉴定与注释蛋白质部分肽段的二级质谱信息与数据库搜寻匹配搜索软件Mascot4、蛋白质生物信息学分析生物信息学在蛋白组研究中的应用常用的生物信息学网站编号蛋白点差异倍数登录号染色体定位号蛋白功能1601-3.77899gi|257304073LOC_Os01g44220glucose-1-phosphateadenylyltransferaselargesubunit2613-4.06071gi|215981467LOC_Os01g44220glucose-1-phosphateadenylyltransferaselargesubunit3614-2.73375gi|257304073LOC_Os01g44220glucose-1-phosphateadenylyltransferaselargesubunit4669-2.06514gi|300544743LOC_Os08g25734glucose-1-phosphateadenylyltransferaselargesubunit5731-2.09161gi|259428287LOC_Os10g25130aminotransferase,classesIandII,domaincontainingprotein6744-2.11623gi|217076017LOC_Os06g04200starchsynthase7774-4.15864gi|257663652LOC_Os03g07570aminotransferase8809-4.07149gi|256535956LOC_Os06g04200starchsynthase9870-2.60834gi|125582731LOC_Os02g38210elongationfactorTu10885-2.03805gi|125564240LOC_Os09g32290FADdependentoxidoreductasedomaincontainingprotein差异表达蛋白点的质谱鉴定差异表达蛋白分类生物途径数据库ID样本数背景数Alanine,aspartateandglutamatemetabolismKEGGPATHWAYosa00250LOC_Os25130.1LOC_Os07570.137/2905CarbonfixationinphotosyntheticorganismsKEGGPATHWAYosa00710LOC_Os25130.1LOC_Os07260.177/2905AminosugarandnucleotidesugarmetabolismKEGGPATHWAYosa00520LOC_Os44220.1LOC_Os25734.289/2905StarchandsucrosemetabolismKEGGPATHWAYosa00500LOC_Os44220.1LOC_Os25734.296/2905差异蛋白生物途径分析表（二）蛋白质组学新技术双向荧光差异电泳（two－dimensionaldifferencegelelectrophoresis，2D－DIGE）同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ）磷酸化蛋白质组学(phosphoproteome）非标记定量蛋白质组技术（label-freequantitativeproteomics）双向荧光差异电泳（DIGE）过程特点荧光染料Cy3和Cy5标记两组蛋白，Cy2标记所有组别蛋白的混合物作为内标；三组蛋白混合电泳分离，通过不同激光扫描，在同一张凝胶上得到三组蛋白图谱。对照处理2DDIGE具有高灵敏度的特性良好的重复性和较高的准确率（二）蛋白质组学新技术双向荧光差异电泳（two－dimensionaldifferencegelelectrophoresis，2D－DIGE）同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ）磷酸化蛋白质组学(phosphoproteome）非标记定量蛋白质组技术（label-freequantitativeproteomics）`iTRAQ：IsotopeTaggingforRelativeandAbsoluteproteinQuantitation`由美国应用生物系统公司ABI研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。多肽体外标记iTRAQ试剂包括三部分（以4标为例）：报告基团：相对分子质量分别为114、115、116和117平衡基团：相对分子质量分别为31、30、29和28，保证同一肽段质荷比相等肽反应标记基团：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共价连接而标记肽段，几乎可以标记所有蛋白质。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记（8标）的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在串联质谱中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，带不同同位素标签的同一多肽产生质量为113-121Da的报告离子，根据报告离子的丰度可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。ResultProteinGroup1254Quantification1243Uniquepeptide5660（FDR≤0.01）鉴定蛋白的数目有定量信息蛋白的数目鉴定唯一肽段的数目LC-MS/MS质谱分析LC液相图谱横坐标:保留时间纵坐标：肽段离子相对强度搜索到的蛋白鉴定的肽段数唯一肽段数蛋白鉴定覆盖率蛋白理论分子量蛋白理论等电点搜索到的蛋白可能有多个gi号，取最典型的gi号，选取次序为：spreffirstgi_number搜索的质谱文件搜索到的肽段理论质荷比与实际检测到的质荷比的差值肽段理论质荷比肽段电荷数该肽段在该质谱文件搜索结果中排名XCorrDeltaCn预打分得分该肽段在预打分结果中排名理论谱与实验谱的离子匹配数|理论谱中离子数该肽段对应的蛋白该肽段对应的蛋白数该肽段对应的蛋白群数这三个蛋白鉴定了完全相同的肽段，因此归为同一个group，称为一个鉴定蛋白群IDReference115:114117:116IPI00000105IPI:IPI00000105.4|SWISS-PROT:Q14764|TREMBL:B4DDR2;B4DXN0|ENSEMBL:ENSP00000349977;ENSP00000378760|REFSEQ:NP_005106;NP_059447|VEGA:OTTHUMP00000045913;OTTHUMP00000081249;OTTHUMP00000081250Tax_Id=9606Gene_Symbol=MVPMajorvaultprotein1.1848692820.754567135蛋白定量表蛋白ID蛋白信息115标记样品/114标记样品蛋白相对定量117标记样品/116标记样品蛋白相对定量peptideratio_biweight115:114sd_biweightrelative_sd_biweightlength_totallen