【农药残留分析】-第四章--农药残留测定方法-3

农药残留分析954.3高效薄层色谱法4.3.1概述薄层色谱法（Thin-LayerChromatography,TLC）是20世纪50年代从经典色谱法及纸色谱法的基础上发展起来的一种微量分离分析方法。1938年N.A.Izmailor和M.S.Schraiber首次在显微镜载玻片上涂布的氧化铝薄层用微量圆环技术分离了多种植物酊剂中的成分，这是最早的薄层色谱法。50年代J.G.Kirchner及J.M.Miller等在上述方法的基础上以硅胶为吸附剂，煅石膏为粘合剂涂布于玻璃载板上制成硅胶薄层，成功地分离了挥发油，从而发展了薄层色谱法；此后，E.Stahl对薄层色谱法的标准化、规范化以及扩大应用范围等方面进行了大量工作，其于1965年出版了《薄层色谱》一书，使薄层色谱法日趋成熟。20世纪80年代以来，随着薄层色谱法的仪器化，出现了高效薄层色谱法（HighPerformanceThin-LayerChromatography,HPTLC），也称现代薄层色谱(ModernTLC)，这是在普通TLC基础上发展起来的一种更为灵敏的定量薄层分析技术。1.高效薄层色谱的特点HPTLC与TLC法比较（表4-15），表现了以下特点：薄层性能薄层的性能对分离效率起决定性作用。HPTLC是由微小颗粒的吸附剂，用喷雾法制备成均匀薄层。由于吸附剂颗粒小，流动相展速慢，容易达到平衡，质量传递的阻滞可以忽略，从而使检出灵敏度及分离效率等方面比普通薄层提高很多。点样薄层上样品展开后所形成的斑点越小而圆（点状点样）或越细而窄（带状点样），分离效率则越好。而斑点大小与原点直径有关，故点样是很重要的步骤。HPTLC采用自动点样器，进行点状或带状点样，采用先进计算机编程控制点样量、点样次数、点样间距、点样速度、点样形状及大小等，使定量分析高度自动化，大大提高了分析结果的重现性。展开HPTLC有多种方式的展开技术。特别是自动多层展开技术（AutomatedMultipleDevelopment，AMD）的广泛应用，使高效薄层板可自动展开多达20-30步，大大提高了分离效果及分析结果的稳定性。其特点是以微机预编程序，设计了一个展开剂极性很宽的梯度程序，展开剂极性由高到低，每一次展距都比前一次增加，每次展开前溶剂按要求混合后由泵送至展开室，展开后自动吹干，并开始下一个程序，这样不仅每次展开后的斑点得到浓集，大大改善了分离效果，而且可以用给定程序在同一薄层上分离极性相差不大的组分。定量分析HPTLC通过采用扫描仪器而实现定量分析，每个斑点最低检出量可以达到ng级。高效薄层色谱法将混合物在高效薄层板上进行分离，在点样、展开等薄层色谱步骤中应用一整套现代化仪器来代替传统的手工操作，再配以高质量的薄层扫描仪，可以得到分农药残留分析96辨率和灵敏度极高的色谱图，大大提高了定量结果的重现性和准确度。在农药残留分析中，高效薄层色谱法已成为高效液相色谱法、气相色谱法等检测手段的一种重要补充。表4-15TLC与HPTLC的比较特性TLC（普通薄层）HPTLC（高效薄层）薄层尺寸（cm×cm）20×2010×10吸附剂硅胶硅胶平均粒度/μm205颗粒分布/μm10-50窄薄层厚度/μm100-250200点样/μl1-50.1-0.2原点直径/mm3-61-1.5展开后斑点直径/mm6-152-5展距/cm10-153-6分离时间/min30-2003-20塔板高/μm≈30＜12有效板数＜600≈5000分离数1010-20点样数1018或36检测限：吸光(ng)荧光(pg)1-550-1000.1-0.55-102.操作流程虽然高效薄层色谱法在较为昂贵的现代化仪器的装备下已具备较高的自动化程度，分析效率也大为提高，但是其操作过程仍是与经典薄层色谱法基本相同，见图4-37。一般实验室如果具有以下基本材料与设备即可开展薄层色谱工作。⑴.薄层板或高效薄层板薄层色谱需根据组分的性质选择不同的固定相涂布在一定大小的载板上，制成均匀的薄层；也可用市售的预制板。⑵.涂布器如果用自制薄层板时需要用涂布器将固定相涂布于载板上，涂布器有手工、半自动或全自动等数种。⑶.点样器定性分析时可用普通毛细管；定量分析时应使用微量或微量定量毛细管，或自动点样器。⑷.展开室根据薄层板的尺寸以及展开方式的不同，用不同规格及形式的展开室。薄层色谱法最常用的是不同尺寸的水平式及直立式两种玻璃展开室。⑸.显色器展开后的薄层板上被分离的组分需要用适当的方法使斑点显示，常用的显色器有两种，一是喷雾器，一是浸板器，这两种显色器均有手工的或自动的。⑹.薄层扫描仪显色后的薄层上各组分的斑点可用薄层扫描仪进行斑点原位光谱农药残留分析97扫描，根据其吸收曲线及最大吸收峰与已知化合物对照进行定性分析；根据斑点面积或峰高与已知量的对照品比较进行定量分析。图4-37薄层色谱法操作流程图4.3.2高效薄层色谱法的原理薄层色谱法采用液体作为流动相，属于液相色谱法范畴，它与高效液相色谱在分离的机理上是相同的，不同的是薄层色谱的分离过程是在平面上而不是在柱内进行，故薄层色谱属于平面色谱法（Planarchromatography）。按其固定相的性质和分离机理可分为吸附薄层法、分配薄层法、离子交换薄层法以及凝胶薄层法等，其中前二者应用较多，本章仅讨论吸附薄层法。吸附薄层法是将吸附剂（固定相）均匀地涂布在玻璃、金属等载板上形成薄层，在薄层的一端点上试样溶液，置于展开室中，将薄层的下端浸入合适的展开剂（流动相），借毛细作用使溶剂上升。此时，试样组分不断地被吸附剂吸附，又被溶剂溶解解吸，如此随展开剂向前移动，由于吸附剂对不同组分有不同吸附能力，展开剂也有不同的解吸能力，因此在流动相向前移动的过程中，不同组分移动的距离不同，从而得到分离。1.保留值保留值是组分在色谱体系中的保留行为，反映组分与固定相作用力的大小，是色谱过程热力学特性的参数，有如下几种表示方式。⑴.比移值（Rf）比移值是溶质移动距离与流动相移动距离之比，是薄层色谱的基本定性参数。薄层的制备与活化点样展开定位定性定量薄层板的预处理样品溶液的制备色谱前衍生化的距离原点中心至流动相前沿心的距离原点中心至组分斑点中fR……………………(4.25)农药残留分析98图4-38薄层色谱示意图图4-38（a）中，A物质的，B物质的。当Rf=0时，表示组分留在原点未被展开；当Rf=1时，表示组分随展开剂迁移至前沿，即组分不被固定相吸附，所以Rf值只在0~1之间，合适的Rf值为0.2~0.8。⑵.高比移值（hRf）为了避免Rf值为小数，有些文献以高比移值（hRf）代替Rf值来作为薄层色谱的定性参数，Rf×100即为hRf值，故hRf值都是在0~100之间。⑶.相对比移值（Ri,s）由于影响被分离物质在薄层上移动距离的因素较多，比如溶质和展开剂的性质、薄层板的性质、环境温度和湿度、展开方式和展开距离等等，因此Rf值的重现性较差。为了补偿一些难于控制的条件变化，常采用相对比移值（Ri,s），其重复性及可比性均优于Rf值。将被分离物质与一参比物质点在同一块薄层上，用相同的色谱条件进行分离，被分离物质（s）和参比物（i）的Rf值之比即为相对比移值，可用下式表示：图4-38（b）中，被测物的。由于参比物的Rf值或移动距离可大于或小于被分离物质的Rf值或移动距离，因此相对比移值可大于或小于1。2.分配系数与容量因子分配系数（K）为液-液色谱中，在两相达到平衡后，某组分在固定相中的浓度（CL）与在流动相中的浓度（Cm）之比，在等温等压下可用下式表示：容量因子（k’）是衡量薄层板对待测组分的保留能力的重要参数。即在两相达到平衡后，某组分在固定相中的质量与在流动相中的质量之比，以下式表示：…………………………………………………(4.27)……………(4.26)caRfcbRf中心的距离原点中心至参比物斑点心的距离原点中心至组分斑点中)()(,sfifsiRRRabRsi,mLCCKba(b)Ri,s值参比物i被测物s原点前沿×Rf值(a)bcA×B×a农药残留分析99式中VL为固定相的体积，Vm为薄层板上的流动相体积。理论上可以推导出，Rf值与被分离组分在两相之间的分配系数（K）及容量因子（k’）有如下关系：因此，k’大时，表示组分被固定相保留的程度大，在薄层上移动慢，反之则移动快。Rf值为1的组分，k’为0，表示该组分不被固定相保留；Rf值为0的组分，k’为∞，表示该组分停留在原点，完全被固定相吸附。3.理论塔板数与塔板高度理论塔板数（n）是反映组分在固定相和流动相中动力学特性的色谱技术参数，是代表色谱柱分离效能的指标，在薄层色谱法中的理论塔板数主要取决于色谱系统的物理特性，如吸附剂的粒度、均匀度、活度以及展开剂的流速及展开方式等。其可以下式表示：式中，D为原点中心到组分斑点中心的距离（cm），W为组分斑点宽度（cm），L为原点至展开剂前沿的距离（cm）。在斑点移动距离相等的情况下，斑点越集中，即W宽度越小，理论塔板数则越大，板效则高。板效的另一种表示方式为理论塔板高度（H），是由理论塔板数（n）及原点到展开剂前沿的距离（L）算出的单位理论板的长度，以下式表示：因此，H与n成反比，n值越大，H值越小，板效越高。4.分离度及分离数分离度（R）表示两个相邻斑点的分离程度，即两个斑点中心距离之差与其平均斑点宽度的比值，可以下式表示：式中，d为相邻两斑点中心的距离差，W1，W2分别为相邻两斑点的宽度。…………………………(4.30)mLmLmLVVKVVCCk''+11=+=kKVVVRLmmf()()2216=16=WLRWDfnDWnLH16==221+2=WWdR………………………………(4.28)…………………………(4.29)………………………………………(4.31)………………………………………(4.32)农药残留分析100因此，相邻两斑点之间的距离越大，斑点越集中，分离效能越好，当R1.5时，相邻两斑点可达到基线分离。分离数（SN）是指在Rf值0~1之间能完全分离的斑点数，SN可由下式表示：式中，a为Rf=1及Rf=0两种组分的斑点中心的距离，近似为原点至展开剂前沿的距离；021W为Rf=0组分的1/2斑点宽度；121W为Rf=1组分的1/2斑点宽度。因此斑点越集中，在相同展距中能分离的斑点数越多，说明板效越高，SN越大，薄层板的容量越大，SN是衡量薄层色谱分离能力的主要技术参数之一。4.3.3固定相1.固定相的选择薄层色谱对固定相的要求包括：⑴.表面积大，常用内部多孔的颗粒和纤维状固体物质；⑵.在展开剂中不溶，对展开剂和试样组分不起破坏或分解作用；⑶.具有可逆的吸附性，既能吸附试样组分，又易于解吸；⑷.为便于观察分离结果，最好是白色固体。为使一组混合物得到很好分离，必须根据被分离化合物的性质（如溶解度、酸碱性、极性等）来选择合适的固定相。分离亲脂性化合物，常选择氧化铝、硅胶、乙酰化纤维素以及聚酰胺；分离亲水性化合物，常选择纤维素、离子交换纤维素、硅藻土及聚酰胺等。对于强极性试样，应使用活性低的吸附剂；对于弱极性试样，则使用活性高的吸附剂。为防止吸附剂与试样组分发生酸碱反应而产生不可逆吸附，吸附剂的酸碱性应与试样保持一致。2.硅胶作为薄层色谱法用的固定相虽然很多，但90％以上的分离都可应用硅胶，因此硅胶是最常用的薄层固定相。⑴.化学组成与结构硅胶为多孔性无定形粉末，表面带有硅醇基（silanol,）呈弱酸性（pH=4.5），通过硅原子上的基与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而表现其吸附性能，由于化合物的极性及不饱和程度的不同形成氢键的能力不同而得以分离，有效硅醇基的数目越多，其吸附能力越强。硅胶能吸附水分形成水合硅醇基而降低吸附能力，但通过150℃活化后的硅胶则因失去吸附水后又增加了活度，此时每nm2上约有4~6个硅醇基。如果温度过高（≥500℃）硅胶脱水形成硅氧烷结构，硅醇基全部失去而使活性大大降低。若加热至1100℃则失去全部水分，因此完全失去吸附能力。为了改善分离的选择性，以硅胶为基质，