鸡蛋中溶菌酶的提取

鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定李莹姝蒋华云*（南京师范大学生命科学学院，南京210046）摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。溶菌酶得率为0.0474mg/100ml（0.03g/kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更好达到纯化效果。关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGEExtraction,purificationandpurityofEgglysozymeYingsLiHuayJiang*(CollegeofLifeScience,NanjingNormalUniversity,Nanjing210046,China)Abstract:Fromeggwhite,with724weakacidcationexchangeresinextractionoflysozyme,andthenelutedwithammoniumsulfate,saltingtobelysozyme.Withdextrangelchromatography(SephadexG-75)purifiedlysozyme,thepeakofthesamplecollection.BySDS-polyacrylamidegel(SDS-PAGE)electrophoresisandidentifiedstepstostaykindofpurityofthesamplesfromlysozyme.Lysozymeyield0.0474mg/100ml(0.03g/kg);dextrangelchromatographypurifiedsamplesobtainedduringelutionpeakcurve,butfailedtocollectsamplesatthepeak;electrophoresisshowedthatthepurificationprocessoflysozymeenzymepurityrising.Inthisstudy,lysozymewasthelowrateofextractionprocesscouldbeimproved,theneedtofurtherreducesamplelosses;chromatographyprocessneedsfurtherproficiencyinordertobetterachievepurification.Keywords:lysozyme,Ionexchangeresin,Gelchromatography,SDS-PAGE溶菌酶(Lysozyme,1,4－β－N－溶菌酶)是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4-糖苷键的水解酶,因而又称为胞壁质酶或者N-胞壁质聚糖水解酶。溶菌酶在临床上是有效的消炎剂,在食品防腐和基因工程等方面也有广泛的应用。[1][2]溶菌酶来源广泛,人、动物、植物和微生物中均有发现,其中鸡蛋清中含量较高,因此,工业生产溶菌酶常以鸡。蛋清为原料鸡蛋清的溶菌酶是研究得最清楚的一种溶菌酶[3]，其化学性质稳定，纯品为白色或微黄色结晶体，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇，是一种分子量在14～15kD，等电点pH值在11.0左右，最适效应温度在50℃，最适pH值为6.0～7.0的碱性球蛋白。它的生物化学功能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁。溶菌酶的抗菌及抗病毒活力与pH值有关，在酸性介质中，活力显著增强。当前,溶菌酶的制备有多种方法，最常用的是离子交换树脂吸附法[4]。溶菌酶的用途很多，由于它本身是一种天然蛋白质，无毒性，可以作为防腐剂、保鲜剂。在医药上，溶菌酶具有多种药理作用，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，广泛应用于临床医学。溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取，在发酵工业上是一种重要的溶菌剂，用于破坏细胞壁，制备无菌提取液。溶菌酶所具有的广泛用途吸引了国内外众多学者对其进行研究，已发表不少关于溶菌酶的试验报道。1材料和方法1.1材料与仪器新鲜鸡蛋3颗,购自市场；724型酸性阳离子交换树脂；灭菌纱布；1mol/LNaOH，1mol/LHCl；蒸馏水（实验室桶装水）；磷酸缓冲液（pH6.5，0.15M）；10％（NH4）2SO4溶液；固体（NH4）2SO4；BaCl2；12﹪分离胶；4﹪浓缩胶；Tris-甘氨酸电极缓冲液；loadingBuffer；标准蛋白Marker；染色液（考马斯亮蓝G-250）；脱色液（冰乙酸，甲醇）；葡聚糖凝胶（SephadexG-75）；蓝色葡聚糖-2000（2mg/mL）；G-75洗脱液（KCl，HAc）电子分析天平；真空泵；超声振荡器；布氏漏斗，循环水式多用真空抽滤泵；玻璃棒，冰水浴，吸管，普通离心机，高速冷冻离心机；透析袋，磁子，磁力搅拌器，玻璃层析柱（20mm×15cm），恒流泵，细滴管，Bio-Rad层析系统设置，部分收集器；水浴锅；Bio-Rad垂直电泳系统（制胶系统、电泳槽）；脱色摇床；可见分光光度计(UV-1100型)；紫外分光光度计；微量移液器；4℃冰箱；容量瓶；精密pH试纸；等。部分试剂详细配方及配法见附录I1.2实验方法1.2.1阳离子交换法提取溶菌酶树脂预处理：干树脂清水浸泡，使其充分膨胀并除去细小颗粒和较大杂质；1mol/L的HCl浸泡2h，去离子水洗3次至至近中性；抽滤收集树脂,1mol/L的NaOH溶液浸泡2h，去离子水洗3次至近中性；抽滤收集树脂,加0.15mol/L、pH值为6．5的磷酸缓冲液平衡过夜待用。蛋清制备：将3个新鲜鸡蛋洗净干燥，小端敲一个小洞，大端打一个小孔进气，分离得鸡蛋清，用1mol/LHCl调节PH到7。过滤前称量烧杯重48.7g，缓慢搅拌用灭菌的两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，蛋清与烧杯总重207.5g，蛋清净重158.8g。用1mol/L的HCl溶液调pH值至7.0，量蛋清体积为100ml。在调节PH时蛋清中出现少量白色沉淀，可能为部分蛋白由于局部过酸而变性。吸附：蛋清在不断搅拌下加入抽滤好的724树脂25g（相当蛋清四分之一体积的树脂），冰水浴中磁力搅拌器缓慢搅拌（使树脂全部悬浮在鸡蛋清中，搅拌不能起泡）吸附2.5h，4℃静置1.5h。然后3000r/min离心15min分层，收集树脂，回收蛋清（留样A）。去除杂蛋白：收集树脂用去离子水振荡水洗直至洗液澄清（至无白沫为止），吸管轻吸去洗液，以去除杂蛋白。（每洗1次，离心1次，总共3次）冰浴中用等体积的0.15mol/L、pH=6.5的磷酸缓冲液搅拌洗涤15min，抽滤，重复洗三次，注意防止树脂流失。最后一次抽滤滤除树脂水分至干燥。洗脱溶菌酶：树脂中加入35ml（等体积）的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30min，抽滤,使溶菌酶从树脂上洗脱下来，重复两次，合并收集洗脱液（留样），洗脱液过滤后，准确量取体积100ml。（留样B）盐析:每83mL洗脱液加32g磨细的固体（NH4）2SO4，本实验中总量为38.55g。缓慢加入（NH4）2SO4搅拌待完全溶解后保鲜膜封口，置于4℃冰箱盐析过夜。透析:待白色沉淀析出，3000r/min离心15min，收集沉淀，用去离子水将沉淀洗下并全部溶解（4.5ml去离子水），装于透析袋中，于去离子水中透析（冰浴），期间2次更换去离子水，直至用BaCl2检测透析完全。透析装置中加入磁子，于磁力搅拌器中搅拌加快透析速度。去杂质蛋白：取出透析袋中的透析液，用0.1mol/LHCl调整pH4.6，产生少量白色沉淀（留样D），可能为杂蛋白。3000r/min离心10min，收集上清液（留样C20ul）。浓缩：用PEG-20000浓缩上清液至1.5ml（留样E，20ul，加loadingbuffer,出现黄色（可能为浓缩时透析袋中渗入了PEG-20000）。[5][6]1.2.2溶菌酶的纯化凝胶溶胀及预处理:取足量SephaexG-75于烧杯中加入20倍体积洗脱液，置室温溶胀2天。反复倾泻去掉细颗粒，并泵脱气；洗脱液用超声脱气完全。测柱床总体（Vt）：取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。在距柱上端约3cm处作一记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接住柱中去离子水（水面降至层析玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt=32.5ml。装柱：在柱中注入已脱气洗脱液（约1/3柱床高度），将溶胀好的凝胶与洗脱液1：3混匀稀释后缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm~2cm高度后打开出水口，常压平衡，胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置过夜，等凝胶完全沉降。过夜后的凝胶柱内颗粒大小分布均匀，松紧一致，填料微孔中无气泡，连接处无死体积。预加样：在胶面上覆盖一层滤纸，接恒流泵，用2倍床体积的洗脱液以0.5ml/min流速平衡柱子，使柱床稳定，期间测定流速是否与预设的一样，并赶走系统中的气泡。用另一支相同的层析玻璃管与层析柱对比得到外水体积为26.5ml。吸去柱上端的洗脱液，打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取1.0mL蓝色葡聚糖-2000沿管壁缓慢加入，打开出水口，等蓝色葡聚糖渗入胶床与胶面相切时，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，柱上端再用洗脱液充满后用0.5mL/min的速度开始洗脱。收集洗脱液没管1.0ml。手动记录时间与对应的OD280并绘制曲线。葡聚糖色带狭窄、均匀平整，层析柱性能良好。蓝色葡聚糖洗下来之后，用洗脱液(1倍床体积)继续平衡一段时间。加样和洗脱：按加葡聚糖的操作方法加入溶菌酶样品溶液1.0mL，用Bio-Rad层析系统设置洗脱条件，以约0.5mL/min的速度洗脱并收集洗脱液每管0.5ml。手动记录时间及检测到的洗脱液在A280nm处的吸光值。将收集管编号置于4℃冰箱保存.合并洗脱峰内的收集管中的洗脱液。（预先测得记录仪至部分收集器的死体积，出现峰值处的收集管延迟死体积所占的管数才为峰值处样品。）1.2.3溶菌酶纯度鉴定制胶：电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。将12%的分离胶加入到电泳槽内的两玻璃板之间，到上口约3cm止，再加一薄层蒸馏水填满，赶走气泡，水与胶面分开并且界面清晰。静置20min，将水倒去。将4%的浓缩胶连续平稳加入至刚刚没过薄板，赶走气泡。迅速从左至右插入梳子，不要留下气泡，静置30min。（取下胶版放入PE手套，加适量蒸馏水4℃保存）点样：将样品与loadingBuffer1:1混匀。将上述处理的各级分样品和蛋白Marker分别加到点样槽中5ul。接通电源先恒压130V电泳，待各样品从浓缩胶进入分离胶后恒压220V继续电泳，直到溴酚蓝距凝胶边缘5mm是停止电泳，关闭电源。染色及脱色：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，小心用塑料板开启电泳厚板和薄板，使胶片完整取下。用塑料板切去浓缩胶部分，分离胶放入大的培养皿用考马斯亮蓝R-250摇床染色20min,回收考马斯亮蓝R-250，在培养皿中加脱色液脱色过夜（期间多次更换脱色液直至背景清楚，条带清晰），并对电泳图谱拍照记录。1.2.4蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度。[7]先用牛血清清蛋白（BSA）及考马斯亮蓝G-250制作蛋白质标准曲线，再根据标准曲线回归方程计算目的蛋白浓度。附：具体组分加样量见附录II2结果和分析2.1凝胶层析纯化图1和图2分别为蓝色葡聚糖和蛋白样品的凝胶层析洗脱图谱。图1层析条件流速0.5ml/min,每2min收集一管。曲线呈明显的尖峰，而且范围狭窄，说明层析柱性