MTT法检测食用菌液体菌种活力的研究

法检测食用菌液体菌种活力的研究马浩，高振江中国农业大学工学院E-mail:[e-mail]中文摘要：本文研究了MTT方法在食用菌液体菌种活力测定方面的工艺条件。结果表明，MTT溶液的最佳添加量为10％，最佳的染色条件是35℃，3小时；最佳的色素溶解条件是35℃，4小时。梯度稀释浓度吸光度的研究表明，浓度与吸光度值之间线性关系明显，线性方程为，线性显著，相关度高，适合作为检验菌种活力的标准。关键词：MTT，液体菌种，活力1．前言食用菌液体菌种技术因其具有生产时间短、生物学效率高、接种简单的特点[1,2]而逐渐的被食用菌生产者采用。然而液体菌种同时又具有老化快，不宜久贮的特点[3]。液体菌种的活力会因为生产工艺、贮藏时间等因素的影响而有很大差别。如何界定菌种的活力水平，是制约液体菌种技术推广的一个瓶颈。MTT染色法是今年发展起来的一种细胞浓度和活力测量的方法。原理是首先通过细胞线粒体内部的琥珀酸脱氢酶（NADH）催化MTT生成有色的晶体物质，然后通过有机溶剂将该物质溶解，再通过比色法测定吸光度值，从而得到相应的细胞活力。1983年，Mosmann在研究哺乳动物细胞凋亡时首次采用了MTT染色法。随后，该方法广泛地应用于动物、植物、微生物细胞的活力检测方面并取得逐步完善。赵承彦，靖志安等的研究[4]表明，MTT溶于水性溶剂，也溶于有机溶剂，但是在水中溶解较好。甲臜不溶于水性溶剂，易溶于有机溶剂，乙醇、丙醇、乙二醇甲醚、DMSO等都是较好的溶剂。甲臜溶解后呈蓝紫色，在570nm处存在吸收波峰。StefanI.Liochev等的研究[5]表明，MTT溶解于PBS溶液，达到5mg/ml的浓度时染色效果较好。C.Stentelaire等在对真菌孢子的MTT染色研究[6]中发现，当溶液pH为5～6时染色效果较好，这与灰树花液体菌种的pH接近，孢子染色的合理温度范围是40℃～70℃，每毫升孢子数量在1×107～5×108范围内与吸光度有极显著的线性关系（R2＝0.99）。本研究将采用MTT作为染色剂，DMSO作为色素溶解剂，进行灰树花液体菌种的活力研究。对实际应用中MTT溶液的用量、染色和色素溶解过程中时间、温度的设定和MTT染色吸光度值与菌种活力曲线进行研究。．实验材料2.1菌种及其制备母种：灰树花1号，中国农业大学生物学院食用菌研究所提供。斜面培养基（PDA综合培养基）：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%。马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用2层纱布过滤，再加葡萄糖糖及琼脂，加热至琼脂溶化后补足水定容，121℃湿热灭菌20min。接种后25℃培养15天，菌丝长满斜面。4℃冰箱贮藏。一级液体菌种的制备：一级液体菌种培养基采用综合PDA去琼脂培养基。母种经斜面活化之后，在超净工作台无菌条件下，用接种铲取0.5cm2左右的菌块接种于装有150ml一级培养基的500ml三角瓶中，每瓶5～7块，恒温25℃静置2天，然后移入恒温水浴振荡器中培养，温度25℃、转速150rpm，振荡培养7天。液体菌种：以10％的接种量将一级液体菌种接种至发酵罐，25℃，通气量60L/min，培养5天。液体菌种培养基采用综合PDA去琼脂培养基。2.2实验试剂MTT：生物纯，Lancaster公司。磷酸盐缓冲溶液（PBS）：称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、0.24g磷酸二氢钾（KH2PO4），加水溶解并定容至1000ml，经121℃，15min高压灭菌。二甲基亚砜（DMSO）：分析纯，北京化学试剂公司。2.3实验仪器恒温恒湿培养箱：LHS250SC，上海一恒科技有限公司。恒温水浴振荡器：HZS-H，哈尔滨市东联电子技术发展有限公司。2L气升式发酵罐:本实验室自行研制。超净工作台：北京昌平长城空气净化设备有限公司。电热鼓风干燥箱：DHG－9140A，上海一恒科技有限公司。立式电热压力蒸汽灭菌器：ZDX－35B，上海一恒科技有限公司。电子天平：AR3130，OHAUS公司。分光光度计：722s，上海精密仪器有限公司。离心机：LG10－2.4A，北京医用离心机厂。3．实验方法3.1MTT溶液用量实验取2ml发酵液装入3ml无菌离心管中，分别加入0.10ml、0.20ml、0.30ml、0.40mlMTT溶液，3组重复。避光置于25℃水浴槽，静止12h。取出样品，离心10min（3000rpm），弃上清液，加入2mlDMSO，摇匀，25℃水浴槽中避光放置12h。离心10min（3000rpm），取上层液，在波长570nm处测量吸光度值，DMSO作为空白。3.2染色条件的优化取2ml液体菌种液装入3ml无菌离心管中，加入0.20mlMTT溶液，避光放置在水浴槽中，温度分别设为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，每小时取样。离心10min（3000rpm），弃上清液，加入2mlDMSO，摇匀，25℃水浴槽中避光放置12h。离心10min（3000rpm），取上层液，在波长570nm处测量吸光度值，DMSO作为空白。3.3甲臜溶解条件的优化取2ml液体菌种装入3ml无菌离心管中，分别加入0.20mlMTT溶液，各取3组。避光置于25℃水浴槽中，静止12h。离心10min（3000rpm），弃上清液，加入2mlDMSO，摇匀，避光放置在水浴槽中，温度分别选择20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。每小时取样，离心10min（3000rpm），取上层液，在波长570nm处测量吸光度值，DMSO作为空白。3.4吸光度值与梯度浓度的关系稀释方法：取100ml发酵液，121℃，15min灭菌，得到无菌种活力的发酵液，使用该液体将新鲜的发酵液分别稀释到原浓度的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，重复3次。测定方法：每个样品取2ml装入3ml无菌离心管中，加入0.20mlMTT溶液，避光放置于25℃水浴槽中，静止12h，离心10min（3000rpm），弃上清液，加入2mlDMSO，摇匀，避光放置在25℃水浴槽中，静止12h，离心10min（3000rpm），取上层液，在波长570nm处测量吸光度值，DMSO作为空白。4．实验结果与分析4.1MTT溶液用量1.221.241.261.285%10%15%20%MTT溶液添加量(v/v)吸光度值图1MTT溶液添加量与吸光度关系可知，对于2ml新鲜液体菌种样品，MTT溶液添加的量达到10％的时候，吸光度即可达到1.259，而当添加量达到15％时吸光度为1.260，变化并不明显，添加量达到20％时，吸光度略有升高，为1.264。相比于添加量为5％时的吸光度值1.225，10％，15%，20%三种情况的吸光度差别较小，因此，可以认为当MTT溶液的添加量达到10％时，液体菌种染色即可完全。4.2染色条件参数的优化温度（℃）时间（h）25303540455010.7781.1320.9020.9481.3571.24520.9851.1861.2561.3851.1501.05431.1171.2911.6181.2341.0380.93241.3301.3561.3471.1050.8920.86451.2141.1451.0850.8970.9210.63961.2521.0831.1500.9280.8860.601表1不同温度不同染色时间对应的吸光度值0123452025303540455055温度(℃)时间(h)图2最大吸光度值出现的时间温度(℃)最大吸光度值图3不同温度的最大吸光度值MTT染色过程是MTT溶液进入菌丝细胞内部并与NADH发生化学反应的过程，最终得到甲臜的量与反应进行的程度有关，较高的温度会使反应加速，染色结束时反应更加彻底，如图2所示，温度越高，吸光度出现最大值的时间越快，即得到甲臜的速度越快，然而，过高的温度也会造成菌丝细胞染色前活力降低或者因死亡而失去活性，致使得到的甲臜数量减少，最终得到的吸光度值偏低，如图3所示，当温度超过35℃以后，最大吸光度值逐渐减小，50℃染色结果明显低于其他温度条件。在液体菌种活力检测的实际应用中，既要求染色的时间短，又要求所得的吸光度值尽可能大，因此，最优的染色条件是35℃水浴，静止3小时。溶解条件优化温度（℃）时间（h）25303540455010.4940.8871.0230.9871.4111.21120.8981.0791.2161.3661.5531.22230.8701.0301.1360.5681.2951.20041.021.0361.4710.9960.5930.87551.2451.4401.0261.1391.1621.136表2不同溶解温度不同溶解时间对应的吸光度值01234562025303540455055温度(℃)时间(h)图4最大吸光度值出现的时间温度(℃)最大吸光度值图5不同温度最大吸光度值甲臜生成的过程也是菌丝细胞死亡的过程，甲臜仍然留在细胞内，DMSO可以与水混溶通过细胞膜将细胞内的甲臜晶体溶解并析出。实验结果表明，随温度的升高，吸光度值达到最大的时间缩短，40℃以上只需2小时即可，而25℃条件下5个小时吸光度值仍明显小于其它的处理，可认为溶解尚未完全（见图4）。由于甲臜溶液具有对光、热敏感的特性，在温度较高的环境下当吸光度达到最大以后即会出现颜色变浅的现象。如图5所示，35℃以上均出现吸光度值随时间变小的趋势，尤其是50℃条件下，最大吸光度值相对最小，因此，可以认为50℃条件下，最大吸光度值出现在1小时之前。在实际操作中，一方面为避免外界因素干扰，希望吸光度值越大越好，另一方面为方便检测，希望吸光度最大值停留的时间越长越好，因此，最佳的溶解方案是35℃水浴，静止4小时。4.4MTT染色法与梯度浓度的对应关系稀释度10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%OD10.4890.5920.8590.7631.1190.8761.0940.9591.2541.176OD20.5840.5250.6951.0250.8691.2131.2210.9451.1741.49OD30.3451.071－－0.8811.1960.9941.2561.1821.021OD平均0.4730.7290.7770.8940.9561.0951.1031.0531.2031.229表3梯度浓度吸光度值稀释浓度吸光度值图6梯度浓度吸光度R值0.9491R20.9007校正R20.8883标准误差0.0793观测值10.0000表4回归分析误差来源平方和自由度均方和F值概率（PrF）回归分析10.45610.456172.570.0001残差80.05030.0063总计90.5063表5方差分析－1上限95%截距0.54230.054210.01310.00000.41740.6672梯度浓度0.74350.08738.51870.00000.54220.9448表6方差分析－2液体菌种梯度浓度吸光度值如表3所示，线性关系如图6所示，回归分析如表4所示，如果将梯度浓度对应的吸光度值以一元线性曲线进行拟合，设线