临床基因诊断进展_陈鸣

临床分子生物学诊断进展陈鸣教授主任医师第三军医大学第三附属医院检验科023-68757601，[e-mail]测序技术乙肝病毒耐药突变检测预测某些疾病的遗传风险程度肿瘤化疗药物敏感试验生物芯片技术固相芯片液相芯片基因组和分子检测：生物芯片技术DNA芯片cDNA芯片Oligo芯片信息生物芯片多肽芯片生物芯片微流体芯片功能生物芯片芯片实验室组织芯片蛋白芯片抗体芯片蛋白质芯片SAGE/CAGEepigenetics芯片质粒microarray微株array基因组genetics转录组mRNAIntroduction“Science”:Foder提出基因芯片概念1991第一张基因芯片：美国Affymetrix公司1992第一张以玻璃为载体的基因芯片：Stanford大学P．Brown实验室，1995“Science”:Schena基因表达谱的研究，1995第一张实用型基因芯片：Affymetrix1996中国科学界第一次专项讨论：第80次“香山科学会议”上，1997年9月1998年度自然科学领域十大进展之一美国正式启动基因芯片计划：1998“生物芯片技术”正式列入国家“863”计划：1999SampleDNAEachspotcontainsknownDNABiochipComplementaryDNAhybridizeSignalappearsBiochipBasedonHybridization724%2%15%29%7%7%16%听力言语视力肢体智力精神多重我国残疾人口有8296万，其中耳聋残疾人群占2004万，占24%，累及2.6亿家庭人口。耳聋人群2006年第二次全国残疾人抽样调查数据8耳聋非综合征型耳聋（70%）遗传因素(约60%)常染色体隐性（80%）环境因素（约40%）综合征型耳聋（30%）Alport综合征Pendred综合征Waardenburg综合征BOR综合征Usher综合征细菌感染病毒感染耳毒性药物声损伤……常染色体显性（15%）X—连锁（1%~3%）线粒体﹙＜1%﹚耳聋的致病因素9中国人群遗传性耳聋的特点遗传性耳聋突变位点具有明显的种族差异中国人群大部分遗传性耳聋由4个基因的突变所引起：GJB2、GJB3、SLC26A4（PDS）、mtDNA12srRNA等中国人群的耳聋突变热点：GJB2：35delG，176del16，235delG，299delATSLC26A4（PDS）：IVS7-2AG，2168AGGJB3：538CT线粒体：12SrRNA：1555AG，1494CT10基因型与临床表型的对应关系线粒体基因C1494T、A1555G突变：——氨基糖甙类药物敏感性耳聋GJB2基因：——先天性重度以上感音神经性耳聋PDS基因：——大前庭导水管综合征（EVAS）一种内耳畸形，先天或后天重度以上感音神经性耳聋GJB3：——后天高频感音神经性耳聋11遗传性耳聋的遗传特点父母均为健康携带者12耳聋基因检测的价值耳聋父亲耳聋母亲子女100%发病尽量避免两个同一基因纯合突变的聋人结婚！针对聋人群体：13耳聋基因检测的价值耳聋父亲耳聋母亲子女正常携带者100%基因检测可指导聋人的婚配，避免婚后再生聋儿！针对聋人群体：14基因在NSHL中所占比例突变热点主要人群比例GJB2~40%35delGCaucasoid50-70%176del16Asiannodata235delGChinese80%299delATAsiannodataGJB3nodata538CTChinesenodataPDS~40%IVS7-2AGChinese50%2168AGChinese10%Japanese50%12SrRNAnodata1555AGChinese7%1494CTChinesenodata现有位点可覆盖中国人群中98%GJB2,80%PDS,90%药物性耳聋患者遗传性耳聋检测试剂盒包括的基因位点晶芯®遗传性耳聋基因检测试剂盒标本采集3管EDTA抗凝的紫头管（最好空腹）16遗传性耳聋检测芯片的检测结果235杂合1555均质IVS杂合2168和IVS复合杂合2168纯合WildTypeControlWildtypeMutation可对四个基因9个位点的基因型进行准确检测，报告野生、杂合突变或纯合突变等三种结果QCBCPCPCNCQC35WIC35538W35MICG3538M176W1494WPC176M1494MBC235W1555W2168W235M1555M2168M299WICmtIVSW299MIC21IVSMICG2BCICIVS检测意义GJB2基因——先天性耳聋基因：当GJB2基因发生突变时，患者出生即表现出耳聋症状检测意义：为耳聋患者确诊病因；指导生育有聋儿的家庭再次生育；筛查有耳聋家族史的家庭成员的基因突变情况；等线粒体12srRNA基因——药毒性耳聋致病基因：当该基因发生突变时，患者听力正常，但当使用氨基糖甙类药物时，就会导致重度耳聋的发生检测意义：通过检测此基因，可以明确被检者该基因突变情况，指导患者用药；明确患者家庭中该疾病的遗传性19GJB3基因——后天性耳聋基因：当GJB3基因发生突变时，患者青少年时期听力正常，当发育至青壮年期间（20～30岁）时，听力逐渐下降，直至发生重度耳聋检测意义：通过检测此基因，可以为听力下降的患者明确病因；指导生育有聋病患者的家庭再次生育；筛查有耳聋家族史的家庭成员的基因突变情况SLC26A4（PDS）基因——大前庭导水管综合征致病基因：当PDS基因发生突变时，患者出生时耳蜗发生畸变，但不发生耳聋症状，当患者患感冒、头部受打击时，听力逐渐下降，直至发生重度耳聋检测意义：通过检测此基因，可以为听力下降的患者明确病因；指导患者生活习惯，指导生育有聋病患者的家庭再次生育；筛查有耳聋家族史的家庭成员的基因突变情况实例介绍122样本由杭州惠耳听力提供父亲：2168突变携带者；听力正常母亲：IVS突变携带者；听力正常孩子：SLC26A4基因复合杂合；聋儿实例介绍223样本由中国聋康中心提供父亲：235突变携带者；听力正常母亲：299突变携带者；听力正常孩子：GJB2基因复合杂合；聋儿实例介绍324父亲：野生型；聋儿母亲：野生型；聋儿孩子：野生型；听力正常样本由大坪医院提供Luminex200TM多功能流式点阵仪液态芯片是基于Luminex200TM（美国Luminex公司）的是一个多功能生物芯片平台，既能检测蛋白、又能检测核酸的高通量技术平台通常用于免疫分析、核酸分析、受体和配体分析等临床检测和科学研究LuminexTM有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号和计算机运用法则，具有很高的检测特异性和灵敏度Luminex200TMLuminexxMAP®Technology-1®Technology-2LuminexxMAP®Technology-24263318525816HPVDNA分型检测液芯操作配套设备多重PCR杂交30-40min2.5hr15min40sec/samplexMAPTM检测抽提DNA标本采集采样刷、细胞保存液、冰箱离心机（10000rpm）、TIP头（大、中、小）、EP管、水浴锅、金属加热器、移液器（1000µl、200µl）、手套、口罩PCR仪（非荧光）、TIP头（大、中、小）、PCR管、PCR实验室流式荧光仪（Luminex200TM）、电脑PCR仪（非荧光）、TIP头（大、中、小）、PCR管液芯HPVDNA分型产品三大优势激光分析，数字结果无需洗涤，减少污染液相杂交，重复性好液相杂交，效率高、重复性好固态芯片产品：膜条式反向杂交，基质不均一，温控困难，重复性差液芯产品：液相杂交，反应彻底，温控严格，重复性好已获SFDA药证的项目HPV分型（高危、低危型，同时检测26种压型）肿瘤标志物（13种）自身免疫性疾病的诊断标记物OUTLINE测序技术乙肝病毒耐药突变检测预测某些疾病的遗传风险程度肿瘤化疗药物敏感试验生物芯片技术固相芯片液相芯片人类基因组计划TheHumanGenomeProject1985:提出对整个人类基因组DNA测序1990:国际合作项目，历时13年花费：$3Billion人类基因组计划TheHumanGenomeProject人类基因组计划TheHumanGenomeProject4.dNTP’s(dATP,dGTP,dCTP,anddTTP)ddGTPddCTPddTTPddATP5.荧光标记的ddNTP’s：不同荧光标记Nowwerunourproductsongel6.DNAPolymerase3.互补的引物5’5’5’5’一个反应1.一个反应中，一个未知片断5’5’5’5’2.有一段已知序列3’3’3’3’7.ddNTP参入----链合成终止3’3’3’3’双脱氧荧光测序方法荧光ddGTPddATPddTTPddCTP同位素Sequenceofunknownfragmentvs.电泳和数据的产生:SequenceofunknownfragmentShortestsynthesizedband=5’endofsynthesizedstrandLongestsynthesizedband=3’endofsynthesizedstrand全自动测序方法AutomatedSequencing测序技术的飞跃2003年，“HGP”获得首张人类全基因组图谱，花费了30亿美元和13年的时间CraigVenter开发出一种快速追踪测序方法，并于2007年9月完成Venter自身全基因组的测定工作，花费了大约1亿美元BadboyofScience测序技术的飞跃2008.4.17《Nature》杂志上，454测序新技术：美国454LifeSciences公司，花了150万美元，4个月IlluminagenomeanalyzerAppliedBiosystemsSOLiDsequencer454sequencing：EmulsionPCR(emPCR)MixDNALibrary&capturebeads(limiteddilution)Create“Water-in-oil”emulsion+PCRReagents+EmulsionOilPerformemulsionPCRAdaptercarryinglibraryDNAABMicro-reactorsAdaptercomplementLoadbeadsintoPicoTiter™PlateLoadEnzymeBeads44μm2020/3/2350测序技术的飞跃Helicos公司开发的HeliScopeSequencer“单分子测序”不需要PCR扩增成本最低目标：10万美元，3个工作日左右一个重要的里程碑在联系个人化基因组和个人化治疗方面破解生命密码并找到缺陷基因对于各种遗传疾病、癌症、肥胖等具有难以估量的意义测序技术在临床上的应用肝炎病毒变异、分型的检测（HBV）预测某些疾病的遗传风险程度（乳腺癌、结肠癌）个体化用药指导（肿瘤化疗用药指导）肝炎病毒变异、分型的检测（HBV）核苷类药物干扰素耐药突变点检测LAMADVETVC基因区变异与肝脏疾病的严重程度有关与抗病毒治疗的效应与肝癌栓塞治疗的效应HBV基因分型可在耐药临床表现发生前1－4个月检测出突变株适时调整用药方案了解病毒在体内存在的状态判断肝癌发生的风险率存在着天然耐药株HBVDNA阳性乳腺癌(breastcancer)发生于乳腺导管上皮细胞的恶性肿瘤是女性常见的肿瘤之一,约占全身恶性肿瘤的7%-10%全世界每年新发乳腺癌约150万例,死亡约57万例GeneticsBRCA-1BRCA-2P53,Rb-1Her-2/ne