质谱原理基础知识MS

什么是质谱？质谱是怎样工作的？质谱仪可以比一枚硬币小，也可以装满非常大的房间。虽然不同仪器类型有不同的应用，但是其工作原理相同。测量单位为道尔顿（Da），代替其它单位，比如原子质量单位（amu）。1Da=单个碳12（12C）同位素原子质量的1/12。以前认为质谱仪不具定量能力，仅能作为定性设备，辅助化合物的鉴定。但现今，已经证实质谱兼具定性和定量功能。只有分子转化为气相离子后，质谱仪才能测量其质量。为了达到这一目的，质谱仪使分子带上电荷，然后将带电离子流转化为数据系统能够识别的成比例电流。数据系统将这一电流转化为数字信息，得到质谱图。图2：a)像色谱图形一样，当总离子电流随时间改变时，总离子电流（TIC）的丰度增加。b)每个峰的数字部分表示此刻的离子，其构成了离子电流，离子电流通常被称为轮廓图或连续采集。X或‘时间'轴为质荷比（m/z），在图谱中（比如同位素）能读出相邻离子的分辨率。c)轮廓图谱通常缩减为‘棒状图，从每个峰的顶点降低质心，形成棒状图，从而减小存放文件的大小，有利于增加分辨信息。对目标分析物，有很多适合的方式，使其电离成离子：1)在平面上，激光激发溶解在基质中的化合物，比如基质辅助激光解吸离子化（MALDI）法。2)通过与带有能量的离子或电子的相互作用，比如电子轰击离子化（EI）。3)自身输送过程的一部分，像我们已熟知的电喷雾电离（ESI），在此种电离中，从液相色谱流出的洗脱液经高电压作用，从气溶胶中形成离子。例子按照其质荷比（m/z），进行分离、检测而得到测量。将相对离子流（信号）与m/z制图，得到质谱图。小分子通常仅带单一电荷：因此m/z是质量与1的比值。1表示在离子化过程中增加了一个质子（表示为M+H+，或如果丢失一个质子表示为M-H-），或如果丢失一个电子形成离子，被称为自由基正离子（M+）。质谱仪的准确性，或质谱仪怎样测量实际真实的质量，可在本入门指南的后续章节中看到。较大分子自身结构的多个位点可捕获电荷。小肽通常能带2个电荷（M+2H+），而非常大的分子具有多个位点，可使用简单的算法，推断谱图中表示的离子质量。图3：当准确校正后，低分辨率的质谱仪也可以得到非常准确的质量，但是因为较多的数据挤占了有限的分辨空间，因此不能提供更多的谱图信息。常见的含有9个氨基酸的Bradykinin多肽的代谢片段（BK1-5或Arg-Pro-Pro-Gly-Phe），ACE（血管紧缩素转化酶）用于扩张血管的抑制剂，可携带2个电荷（单个电荷或M+H的单同位素值为573.3149，而双电荷峰，或M+2H为287.1614）。戴带双电荷的同位素峰，也会挤占有效的分辨空间。能够分析的分子有多大？解吸电离扩展了分析的能力，可分析分子量大、非挥发性、易碎的分子。对分子量40,000Da的常规检测，其准确度可达0.01%，（即质量偏差在4Da）允许过程中发生较小变化的测定，比如蛋白质的翻译后修饰。可带多个电荷扩展了质谱仪的测量范围，可以超越其设计的上限，可检测1000000Da或更大的质量。同位素和元素的质谱仪天然同位素丰度已清楚的表征。虽然通常认为丰度比较稳定，但是同位素丰度可能出现显著的特征性改变。在代谢研究中，应用同位素比例测定（同位素丰富的元素作为示踪剂），在气候研究中，测量温度依赖性氧和碳的变化。在实际中，使用高准确性的质谱仪，测量前，将复杂分子转化为简单分子化合物，这样转化后的化合物能通过扇形磁质谱仪检测。元素分析通常针对无机材料，确定元素组成，而不是结构，在一些情况下，可分析固体金属样品。常见于诱导偶合等离子体（ICP）源，放电器（或较低能量的发光放电）电离样品。在万亿分之一（ppt）水平使用专用仪器检测较为常见。常见的电离方法常见的电离方法电子离子化[EI]电子电离（EI）为很多人所熟知。（在较早的时候称为电子撞击，但是从技术上来说不准确。）EI，通常将样品暴露在70eV的电子下，被称为硬技术。电子与目标分子互作用的能量，通常要比分子的化学键要强的多，因此分子发生电离。过量的能量按照特定方式打开化学键。结果产生能够预见的、可鉴别的碎片，通过这些碎片，我们能够推测出分子结构。这些能量可将单个电子激发，从分子外层逸出，形f成正离子自由基，得到丰富的碎片波谱。不同于较软的大气压电离技术，波谱响应会受到离子源设计特征的影响，EI技术完全独立于离子源的设计。同一化合物在一台EI质谱仪产生的图谱与另一台EI质谱仪得到的图谱非常相似，基于这一原理，可建立图谱库，将未知化合物的谱图与参照谱图比较。化学电离[CI]分子过度裂解的称为软技术。化学电离（CI）通过一较温和的质子转移过程生成离子，有利于分子离子的生成。将样品暴露到大量的溶剂气体，如甲烷形成质子化的分子离子（M+H）。反向过程将形成负离子。在一些情况下，质子被转移到气体分子上，形成负离子（M-H）。采用EI分析时，碎片丰富的化合物，有时可采用CI分析，以增加分子离子的丰度。类似于EI，样品必须具有热稳定性，因为在离子源里，被测物需要加热气化。对起始电离步骤，CI的电离机理依赖于EI，但是在离子源里是有高压化学反应气体，比如甲烷、异丁烷或氨。比被测物（R）的浓度高很多反应气体通过电子电离作用，发生电离，起初产生R+t，溶剂离子。R+离子与中性R分子发生碰撞，形成稳定的次级离子，其具有反应性，然后通过离子分子反应，使被分析物分子（A）离子化.负离子化学电离[NCI]对含捕获电子基团（例如，氟原子或硝基苄基）的被测物，能形成负离子化学电离（NCI）。比EI的灵敏度提高了很多倍（据报道，在某种情况下可提高100到1000倍以上）。NCI广泛应用于各种小分子，这些小分子通过或能够被化学修饰，促进电子捕获。在负离子中，有两类主要的负离子形成机制：电子捕获和反应物离子化学离子化。在CI条件下，电负分子能够捕获热电子，产生负离子。实际上的负离子化学电离，通过被测化合物（AH）与带负电的反应离子（R-或R-）之间反应引起电离。可能存在几类离子分子反应的类型，最常见的是脱质子反应。气相色谱[GC]可能对很多人来说，第一次接触质谱是将其作为气相色谱的检测器。GC/MS联用仪类型的范围已大大扩展，超越早期仪器设计的范围，在使用中满足日渐严格的法规要求，像环境分析、食品安全筛查、代谢组学，以及包括法医学、毒理学和药物筛查的临床应用。在过去，两种类型的质谱主导着GC/MS分析：扇形磁场和单四极杆质谱仪。对于前者，可提供高分辨率和准确的质量分析，用于有极高灵敏度要求的分析中。后者适合目标化合物的常规分析。[液相色谱]扇形磁场质谱仪，具有最具挑战的GC/MS分析能力：环境或工业样品中的二英，或竞技比赛中非法使用兴奋剂的筛查。在扇形质谱仪上能够以飞克（fg）检测水平进行高分辨率或选择性的分析。四极杆GC/MS系统推出不久，在目标分析应用中就已取得认可。美国环境保护局（USEPA）要求对大量环境污染物样品采用四极杆GC/MS质谱仪分析。因为这些分析应用的检测极别仅在皮克到纳克之间，相对于扇形磁场来说，四极杆磁场的灵敏度较低，但四极杆并没因此受到限制，相反，采用四极杆可大大降低成本，方便使用，并且便于携带。液相色谱[LC]这是一项革命性的技术，为大约80%不能采用GC分析的化学物质提供了分析途径，在近几十年来促进了质谱技术的显著提高。少数几个模型被挑出来，开始实现MS与LC联用。可以说LCMS联用开始于1970年代，在1990年代早期，我们今天所熟知的LCMS技术成熟起来。很多现在我们使用的装置和技术都直接来自那个时候。在1900年代早期，俄国植物学家MikhailS.Tswett定义了液相色谱技术。他的研究工作主要是分离从植物萃取的叶色素，在他的研究中，他用溶剂冲洗装填微粒的柱子。这是液相色谱最简单的形式，被测物溶解的溶液（流动相或浓缩相）与溶液流过的装填颗粒的床体（固定相）之间存在竞争作用，液相色谱就是依靠这种可预测、不断再现且具有很高精确性的相互作用实现分离。近年来，在色谱柱中装填各种功能性组分，以及能够准确传送流动相的溶剂输送系统的发展，使得LC成为很多分析行业的支柱。首字母缩略词HPLC是由CsabaHorváth在1970年提出，表明对液相色谱填充柱需要施加高压，以引起液体流动。从那以后，液相色谱的效能不断提高，较小颗粒的填料和较高的选择性上都取得了发展，将首字母缩略词改为高效液相色谱。[电喷雾电离]在2004年，色谱仪和柱技术得到进一步的发展，提高了液相色谱的分离度、分离速度和灵敏度。使用较小颗粒填料的色谱柱（1.7微米）、以15000psi（1000巴）的压力输送流动相的特殊设计色谱仪被称为超高效液相色谱（UPLC®技术）。在1970年代，JohnKnox等研究人员已经预测了UPLC所包含的很多技术特征。Knox预测最佳颗粒直径是1-2μm，并且色谱对摩擦热热灵敏。在UPLC技术开发过程中，必须解决如何制作抗干扰、均一的小颗粒填料的技术。HPLC和UPLC的基本入门手册，可在上找到。电喷雾电离[ESI]大气压电离（API）的最重要的技术是ESI，ESI为各相关技术提供了基础，这些相关技术能在大气压，而不是在真空（托）下形成离子。样品溶解在极性溶剂中（一般比GC上使用的溶剂更难挥发），然后泵入不锈钢毛细管，不锈钢上施加2000到4000V的电压。当液体在大气压下，从毛细管流出时，液体被雾化，被雾化的液滴进一步去溶剂，释放出离子进入质谱仪。在静电吸引和真空联合效应下，诱导电离生成这些气态离子。图4：位于前端的ESI探针简易图，与MS离子入口垂直。当溶剂进入分析器的稀薄真空区域时，锥体或逆流气通常辅助液滴去溶剂化。电势从液体转移到被分析物从而形成离子的机制仍然是个争论的主题。在1968年，MalcolmDole提出电荷残留机制，在该机制中，他假定当液滴挥发时，液滴的电荷仍保持不变。液滴表面张力最终不能平衡电荷斥力，将小液滴炸裂成很多更小的液滴。持续发生这样的库仑力爆破，直到小液滴只含单一的被测物离子。当溶剂从最后形成的小液滴中挥发掉，即形成气态离子。在1976年，Iribarne和Thomson提出了一个不同的模型，即离子挥发机制，在该机制中，通过库仑裂解形成小液滴，这类似于Dole模型的形成方式。但是，按照离子挥发理论，在液滴表面的电场强度相当高，使溶剂化离子逸出液滴表面，并直接将其转移进入气相，形成气态离子。实际上，这两种机制可能协同起作用：对于大于3000Da的物质，电荷残留机制起主导作用，而对于较低质量的分子，离子挥发机制起主导作用（参见R.Cole，关于电喷雾电离质谱的一些原则，质谱杂志，35，763-772[2000]）。液相色谱的流出物，以电荷平衡状态进入ESI探针。因此当溶剂离开ESI探针，溶剂需携带有净电荷。为了确保ESI具有连续性，必须通过电化学反应给溶液充电，将电子转移到电极表面。在其它的效应中，该过程可能引起溶液pH值的变化。据推测，在阳离子模式时，带正电液滴离开喷雾器，电极（氧化作用）必定要吸收电子。（在阴离子模式下，则相反。）电活性电极的表面面积、电流大小和化学品种类及其电极电势的特性都将产生影应。总的来说，ESI是一高效过程。不过，反应的活化量和能量差异对不同的物种是不同的。溶液流速和使用的电流对每个液滴形成也有限制。分子间的竞争以及目标被测物抑制效应也较为常见。图5：离子形成之后，离子被拖过电势梯度（电场），到达计数板。扩展ESI的基本理论，比如将液体的体积极端的减小，例如在纳喷雾时，液体体积流速减少到30nL/min，这已经证实可提高效率，尤其在蛋白质和氨基酸这种样品非常宝贵、稀少的研究中。大气压化学电离[APCI]虽然大气压化学电离（APCI）技术与ESI同时发布，但是在1985年Fenn的研究成果发布，ESI很快商业化，而直到此时，APCI也没有广泛被采用。在1973年，Horning首次提出APCI，采用包括HPLC在内的各种导入技术，分析挥发性组分。APCI的附加功能是，将ESI难以转化为气相离子的被测