质谱技术分析

第三章质谱技术Massspectrum－MS内容：第一节质谱学基础第二节高效液相色谱－质谱联用第三节生物质谱简介第一节质谱学基础什么是质谱质谱仪的基本结构质谱仪的主要性能指标质谱图及其判读第二节高效液相色谱－质谱(HPLC-APIMS)HPLC-ESIMS(电喷雾电离)√HPLC-APCI(大气压化学电离)√HPLC-APPI(大气压光致电离)HPLC－APIMS方法开发LC－MS联用所面临的两大问题液相色谱流动相的量比质谱所能忍受的量大得多。典型流量是1mL/min,气化后相当于气体流速150－1200mL/min，而现代质谱只能忍受的气体流量只有1－20mL/min；液相色谱的研究对象是难挥发和热不稳定的化合物，这些化合物用常规电离方法是很难电离的。关于LC－MS的研究主要致力于解决上述两个问题。LC/MS电离技术的相对适用性HPLC-ESIMS(电喷雾电离)检测器喷雾室离子阱加热的氮气干燥气双电子毛细管入口雾化气(气体用红色显示))溶剂喷雾++电喷雾离子-4000V电喷雾电离源API-ElectrosprayIonSource高电压装置电喷雾电离－离子形成的必要步骤•步骤1溶液中的电离•样品的pKa•溶液的pH•步骤2喷雾•表面张力和粘度•气动辅助•步骤3去溶剂•干燥气温度和流速•热容量，Hvap•步骤4离子从溶液中解吸•溶解能•步骤5气相中的离子反应•质子亲合力•电荷交换步骤1－在溶液中如何产生离子？离子种类NH4+PO4-酸/碱化学性质M-NH2+酸[M-NH3]++酸-（正离子检测）M-COOH+碱[MCOO]-+碱+（负离子检测）缔合（对类似糖的中性物质）M°+Na+[M-Na]+（碱金属，如20mM乙酸钠）衍生化形成离子或酸/碱产物步骤2－气动辅助电喷雾－产生带电液滴含有约100,000电荷、直径2mm的带电溶剂液滴由于溶剂组成或流速，气动喷雾减小了液滴的大小对粘度和表面张力的偏离喷雾柱体、端板和毛细管上的场使液滴带电步骤3－带电液滴的去溶剂热干燥气体加热的氮气蒸发了液滴，增加了电荷/体积比。Rayleigh极限是带电液滴能够存在的最大电荷/体积比。当电荷超过这个极限时，发生库仑破裂。液滴的Con’t库仑分裂•Rayeigh破裂释放出较小的最终变成样品离子的液滴。50-100nm带电液滴－包含100个电荷•这些液滴包含母体液滴中10-20%的电荷但仅仅2%的质量。步骤4－从溶液中解吸离子当液滴的场强超过分析物在溶液中的溶解能时，离子解吸进入气相。带电残余物离子蒸发蒸发Rayleigh极限Coulomb爆裂蒸发被分析离子步骤5－气相中的离子反应通过离子传输区域时从大气压喷雾室的反应中会发生质子转移和电荷交换反应。这个高压区允许发生1000次离子/分子反应。•质子转移:气相质子转移反应使分子带电[M]+[NH4]+[M+H]++[NH3]帽电压裂解区雾化气压力干燥气温度和流速雾化气压力200mL/min10-20psig200-400mL/min20-30psig400-800mL/min30-50psig800mL/min50-70psig干燥气流速(6-12L/Min)含水高需更高的流速如果太底，液滴会导致谱图中的尖峰当有疑问时，使用过量的干燥气温度蒸汽压越低的溶剂温度越高开始为300-350C帽电压用FIA优化(2000-5000)开始3000V在负离子模式，注意高的室电流或兰色光辉（电晕针显示）：当这现象发生时须降低帽电压电喷雾喷雾室设置样品在溶液中为离子态:儿茶酚胺、硫酸酯共轭物、丁基胺有可诱导电离的化合物：甲醇含杂原子的化合物：氨基甲酸酯类，苯并二氮杂草类溶液中带多电荷：蛋白质、多肽、低聚核甘酸溶液化学参数流速样品的pK,溶液pH溶液导电性应避免的样品尤其非极性的样品：PAHs,PCBs电喷雾需考虑的问题[溶剂+H]++A溶剂+[A+H]+雾化蒸发液滴气相电离HPLC-APCI(大气压化学电离)APCI离子化机理VcapCoronacurrentNebulizerPressureFragmentorDryinggasTemperatureandFlowHeaterAPCI离子化机理气化溶剂电离电荷交换给分析物N2(从干燥气)+e-N2++2e-N2++2N2N4++N2N4++H2OH2O++2N2H2O++H2OH3O++OHH3O++M[M+H]++H2OAPCI离子源电晕针HPLC流速500mL/min雾化气压力60psig干燥气温度startwith350C干燥气流速4L/min气化温度随FIA调节帽电压随FIA调节(2000-6000)开始2500V电晕电流随FIA调节开始25µA(neg)或4µA(pos)帽电压电晕针电流雾化气压力碎裂区干燥气温度和流速加热器APCI喷雾室的设置样品分子量和极性中等的化合物：PAHs,PCBs,脂肪酸,邻苯二甲酸酯类；不含酸性和碱性位点的化合物（碳氢化合物、醇、醛、酮和酯）；含有杂原子的化合物：脲、苯并二氮杂草、氨基甲酸酯；具有一定挥发性的化合物,排除了分子量较大和极性较大的分子,如蛋白质/多肽；电喷雾响应不好的样品；溶液化学参数较ES对溶液化学作用不灵敏较ES更耐大的流速适用ES不宜的一些溶剂应避免的样品在气化过程中热不稳定的化合物APCI需考虑电喷雾电离:其电离过程通过电场产生带电液滴，接着样品离子通过离子蒸发后，进行质谱分析。适用于在溶液中为离子态或可诱导电离的化合物。适用于分子量较大和极性较大的分子,如蛋白质/多肽；大气压化学电离(APCI):气相化学电离(CI)过程中溶剂相当于CI反应气来使样品电离。适用于分子量和极性中等的化合物和具有一定挥发性的化合物,排除了分子量较大和极性较大的分子。小结HPLC－APIMS方法开发HPLC－MS用途成份确认或定性及半定量，如合成产物分析，FIA无光谱吸收物质的定量低含量和色谱未分离成份的测定，如杂质检查，SIM，LC条件优化未知样品的分析，如中药分析，与DAD结合,Multi-channeldataacquisition大分子样品分析，pH至关重要样品前处理质谱检测条件检测离子模式，离子化参数设定液相色谱条件ESI液质分析APCI液质分析样品导入方式Infusion,HPLC,FIA柱后修饰技术样品前处理了解样品情况种类纯度或含量，溶解度，存储条件，挥发性，热稳定性分子结构，pK值，pI值影响LC/MS分析的主要因素盐背景或基质成份(离子化)浓度–ng/ml,dimer真空度，溶剂雾化质谱条件-离子源选择（1）ESI待测物无需有挥发性热不稳定成份首选离子在溶液中已形成形成单电荷离子和多电荷离子流速750µL/minAPCI待测物需有一定挥发性待测物对热稳定离子在气态中形成只形成单电荷离子流速500µL/min质谱条件-离子源选择（2）ESI在溶液中已是离子态catacholamines,sulfateconjugates,quaternaryamines含杂原子化和物carbamates,benzodiazepines带多电荷成份proteins,peptides,oligonucleotides对APCI响应弱的物质APCI中等分子量和中等极性成份PAHs,PCBs,fattyacids,phthalates,alcohols,aldehydes,ketones，etc.含杂原子化和物carbamates,benzodiazepines对ESI响应弱的物质质谱条件-离子模式选择正离子ES模式：适合于碱性样品，amines,amides,aminoacids,antibiotics，etc有杂原子(N2O2)可接受H+、Na+、NH4+，如NH2、N、NH、CO、COORpHpK-2负离子ES模式：适合于酸性样品，acids,hydroxyls,phosphates,sulfates；含强负电性基团物质有无杂原子(O2N2)可失去质子?COOH、SH、NO2pHpK+2可正可负:比较灵敏度质谱条件-API参数设定ESI–Foraqueouslevelsabove50%HPLCFlowrate(µl/ml)NebulizerPressure(psi)DryingGasFlow(l/min)DryingGasTemp(0C)1-1010-15432510-5015-20532550-20020-408350200-50030-508-10350500-100050-7010-12350HPLCFlowRate(µl/min)NebulizerPressure(psi)DryingGasFlow(l/min)DryingGasTemp(0C)APCITemp(0C)*200-1500604350300-500APCI–Goodsensitivityatabove500µl/min，*-需优化液相方法转为液质联用需要考虑：-色谱分离和待测物离子化待测物的离子化能力流动相及流速与质谱的匹配性色谱柱与质谱的匹配性色谱柱流动相流速液相条件-选择相应的色谱柱ApplicationColumnI.D.FlowRateStandard2-4mm500-2500µL/minNarrowbore1-2mm100-500µL/minMicroLC1mm800µm40µL/min20µL/minCapillaryLC300µm180µm4µL/min2µL/minNanoLC100µm75µm50µm300nL/min180nL/min80nL/min液相条件-色谱柱内径选择ESIFlowrate:1-1000μl/min1.0,2.1,3.0mmid建议用2.1mm浓度相关反相流动相APCIFlowrate:50-1500μl/min4.6,3.0,2.1mmid建议用4.6mm浓度不相关，进样多，信号强反相和正相流动相液相条件-色谱柱颗粒度选择5μmParticles扫描模式widerpeakwidth简单样品3.5μmorParticlesSIM,增加灵敏度增加分辨率缩短分析时间复杂样品等度组份液相条件-色谱柱长度选择短柱（15-75mm)缩短时间SIM，Multipleionmode简单样品易区别分子量长柱（150or250mm)提高分离效果扫描模式Multiple–ionmode复杂样品等度分离液相条件-流速ESI浓度敏感•微径柱得到更高灵敏度最佳工作流量：100-500µl/min柱后添加调节离子化效率色谱未能分离的组份，可用萃取离子模式进行定量APCI质量流量敏感•柱内径对灵敏度的影响极小最佳工作流量：500-1500µl/min可用正相色谱色谱未能分离的组份，可用萃取离子模式定量液相条件–与API-MS匹配的溶剂ForESIandAPCIMethanolEthanolPropanolIsopropanolButanolAcetonitrileWaterDMFDMSOAcetoneCH2Cl2CHCl3ForAPCIonlyTolueneBenzeneHydrocarbons(e.g.,Hexane)StyreneCCl4CS2CyclicHydrocarbons(e.g.,Cyclohexane)~强挥发性，不易形成加和物~介电常数适中，避免喷口放电~显著质子自递作用液相条件–常用缓冲盐(挥发性)ForESIandAPCIAceticacid,pH3.8-5.8Ammoniumacetate,pH6-7Ammoniumformate,pH5-6Ammoniumhydroxide,pH8.2-10.2FormicacidHeptafluorobutyricacidTriethylamineTetrabut