产前染色体Fish

目录第一部分产品信息.......................................2一、产品基本信息.......................................2二、实验相关试剂配制...................................4第二部分FISH相关操作说明..............................6一、样本玻片制备....................................6二、玻片预处理.....................................7三、变性杂交操作步骤...............................8四、玻片洗涤......................................10五、复染..........................................10六、FISH结果观察..................................11七、FISH结果判断..................................12八、检测结果的解释.................................12第三部分附表..........................................13一、附表一实验报告单..............................13二、附表二计数指南................................14三、附表三常见问题图释及解答.......................15四、附表四常见问题解答............................16产前染色体数目检测试剂盒2【产品名称】通用名称：产前染色体数目检测试剂盒（荧光原位杂交法）英文名称：FISHkitforthedetectionofchromosomenumericalanomaliesinprenataldiagnosis【医疗器械注册证书编号】国食药监械（准）字2009第3400010号【包装规格】5人份/盒、10人份/盒、20人份/盒【产品信息】产前染色体数目检测试剂盒（荧光原位杂交法）说明书试剂位点规格GLP13/GLP21CSP18/CSPX/CSPY杂交液①GLP13/GLP21使用GLP杂交缓冲液②CSP18/CSPX/CSPY使用CSP/WPP杂交缓冲液DLEU2：13q14DSCR2：21q22CSP18：18p11.1-q11.1CSPX：XP11.1-q11.1CSPY:YP11.1-q11.15人份10ul10人份20ul200ul20人份40ulTelomereCentromere21q22regionGLP21GLP21240kbTelomereCentromere13q14regionGLP13GLP13340kb探针模式图产前染色体数目检测试剂盒3YX18【储存条件及有效期】-20℃避光、密封储存；避免多次反复冻融。自生产之日起有效期为一年。【样本要求】5-10ml新鲜、未经培养的羊水用于FISH实验玻片制作，推荐制片3-4张。羊水细胞的收集要尽量避免母体细胞的污染；要迅速、及时（不要过夜）。样本要避免温度过高和过低，可短时间存放于4℃冰箱，不能冻存。【设备仪器】1.荧光原位杂交成像分析系统，包括荧光显微镜及相应的滤光片组、分析软件2.42℃恒温孵箱或杂交仪，立式染缸（考普林瓶）、计时器、水银温度计3.恒温水浴箱、旋涡混合器、迷你离心机、烤片机、移液器4.pH计或精密pH试纸、载玻片、盖玻片、0.5ml离心管、15ml离心管Yp11.1-q11.1红色Xp11.1-q11.1绿色18p11.1-q11.1天蓝色探针模式图产前染色体数目检测试剂盒4充分混匀，室温下10MNaOH调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至1L。使用期间2-8℃储存。试剂配制6个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。2.缓冲液：2×SSC,pH7.0±0.220×SSC（pH5.3）100ml去离子水800ml3.变性液：70％（v/v）甲酰胺/2×SSCpH7.0-8.0甲酰胺35ml20×SSC（pH5.3）5ml4.乙醇溶液：70％乙醇、85％乙醇充分混匀，室温下调节pH值至7.0-8.0，用去离子水定容至50ml。使用期间2-8℃储存。试剂配制7天后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。将700ml、850ml无水乙醇，用去离子水分别稀释至1L。使用期间2-8℃储存。试剂配制1个月后或用于20张玻片杂交后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。6.洗涤液：0.1%NP-40/2×SSC溶液,pH7.0±0.220×SSC（pH5.3）40mlNP-400.4ml去离子水300ml充分混匀，室温下10MNaOH调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至400ml。使用期间2-8℃储存。试剂配制6个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。5.甲酰胺洗涤液：50%（v/v）甲酰胺/2×SSC甲酰胺75ml20×SSC（pH5.3）15ml充分混匀，室温下调节pH值至7.0-8.0，用去离子水定容至150ml。使用期间2-8℃储存。试剂配制7天后或用于20张玻片洗涤后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。【实验相关试剂配制】1.缓冲贮存液：20×SSC,pH5.3氯化钠88g柠檬酸钠44g去离子水400ml充分溶解，室温下12MHCl调节pH值至5.3，用去离子水定容至500ml。高压灭菌；使用期间2-8℃储存。试剂配制6个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。产前染色体数目检测试剂盒59.固定液（甲醇：冰乙酸体积比3：1）：量取30ml甲醇和10ml冰乙酸，充分混合。使用前新鲜配制。10.1MHCl：7.快洗洗涤液：0.3％NP-40/0.4×SSC溶液,pH7.0-7.58.胶原酶B溶液（1mg/mlHank’sBSS）：充分混匀，室温下10MNaOH调节pH值至7.0-7.5，用去离子水定容至1L。使用期间2-8℃储存。试剂配制6个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。称取胶原酶B50mg，用50mlHank'sBSS液溶解，37℃搅拌溶解1小时，4℃过夜，滤过消毒，-20℃分装储存。用去离子水定容至100ml，室温储存。试剂配制1个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。20×SSC（pH5.3）NP-40去离子水20ml3ml950ml浓HCl去离子水8.2ml80ml14.甲醛固定液：充分混匀，使用前新鲜配制。备注：正确的操作程序保证试剂的质量(1)为得到好的结果，需确保试剂按照说明书正确配制。(2)使用校准过的温度计测量考普林瓶中的溶液温度。(3)用于实验的2×SSC、0.1%NP-40/2×SSC、0.3％NP-40/0.4×SSC溶液和胃蛋白酶工作液不可反复使用。市售甲醛PBS（pH7.2-7.4）MgCl2.6H2O1ml39ml0.18g13.KCl低渗溶液（0.075MKCl）：充分混匀，用去离子水定容至500ml。使用期间2-8℃储存。试剂配制1个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。KCl去离子水2.795g300ml11.0.01MHCl：取0.4ml1MHCl，加去离子水定容至40ml。12.胃蛋白酶工作液（0.08mg/ml）：取3.2mg胃蛋白酶粉剂溶于预热至37℃的40ml0.01MHCI，混匀。使用前新鲜配制。产前染色体数目检测试剂盒6【样本玻片制备】1.试剂：胶原酶B溶液、KCL低渗溶液、固定液。2.玻片制备程序：FISH相关操作说明(1）收集细胞。取5-10ml羊水细胞样本置于15ml离心管中，1200rpm，离心10分钟。注:羊水样本需当天进行处理；若取得的样本若未能立刻处理，在当天内未处理前，可暂存于4℃中。(2）胶原酶消化。去上清，加入1.5-5ml胶原酶B溶液，用力吹打悬浮细胞，37℃水浴温育20-40分钟（根据样本粘液多少调整胶原酶B用量及时间），期间吹打3－4次。(3）1000rpm，离心10分钟。(4）低渗。去上清，加入5ml预热至37℃的KCl低渗溶液，轻吹打悬浮细胞，37℃水浴温育20-30分钟，期间吹打2－3次。(5）预固定。直接于细胞低渗混合液中缓慢加入1-2ml固定液，混匀。(6）1000rpm，离心10分钟。(7）固定。去上清，加入5ml固定液，混匀，静置10分钟。(8）1000rpm，离心10分钟。(9）重复步骤（7）和（8）。(10）细胞悬液的制备和保存。去上清，根据细胞量加适量固定液，制成浓度合适的细胞悬液；混匀后滴片。此细胞悬液置-20℃冰箱中可保存1个月。在此期间可随时取出，离心去上清加入新鲜固定液，制片供FISH检测之用。（新鲜的标本容易得到好的杂交信号，建议使用新鲜标本）(11）制片。用吸管将细胞悬液轻轻吹打混匀后吸取少量，滴至干净的载玻片上，自然晾干。剩余标本置于-20℃冰箱备用。（根据明场显微镜下观察确定合适的细胞密度）(12）老化玻片。室温放置过夜或56℃烤片至少30分钟。玻片放入片盒中，室温干燥保存。建议不要将制好的片子放置太久，否则会影响信号的质量。通常情况下，片子老化后马上进行检测。（玻片老化时间或温度不足会导致实验操作中出现严重细胞脱落现象）产前染色体数目检测试剂盒7【玻片预处理】1.试剂：0.01MHCl、胃蛋白酶工作液、2×SSC、70%乙醇、85％乙醇、100％乙醇、甲醛固定液。2.预处理程序：(1)将40ml0.01MHCl倒入一考普林瓶中并置于37℃水浴箱中预热。(2)将玻片置于37℃2×SSC溶液中浸泡10分钟。(3)将3.2mg胃蛋白酶粉剂溶于预热至37℃的40ml0.01MHCI，混匀，制备成终浓度0.08mg/ml的胃蛋白酶工作液。将玻片置于37℃胃蛋白酶工作液中浸泡10分钟。（胃蛋白酶可以较温和地消化细胞蛋白质,增强细胞的通透性和核酸探针的穿透性。此外胃蛋白酶也具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。胃蛋白酶消化时间需要根据标本细胞差异进行调整。胃蛋白酶的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高，会对细胞的结构有一定的破坏，导致细胞脱落较多，细胞核消失或细胞核辨认不清；胃蛋白酶消化不足会影响细胞的通透性以及杂交信号的强度和杂交率）特别说明：为确保消化充分，可以自然干燥玻片，将15µlDAPI复染剂滴加于标本区域，立即盖上盖玻片。暗处放置10-20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤片组观察消化情况。如果消化过度，可放弃本次FISH实验，选择的标本玻片重复实验，缩短胃蛋白酶消化时间；如果消化不充分，可将标本玻片浸泡在2×SSC溶液中帮助脱落盖玻片，盖玻片脱落后，于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5分钟，然后将标本玻片置于37℃胃蛋白酶工作液中继续消化；如果消化适中，可将标本玻片浸泡在2×SSC溶液中帮助脱落盖玻片，盖玻片脱落后，于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5分钟，继续第5步实验操作。(4)室温下于2×SSC溶液中漂洗玻片2次，每次5分钟。(5)室温下于甲醛固定液中固定10分钟。（为保持细胞结构，胃蛋白酶消化后室温下用甲醛固定液固定）(6)室温下将玻片依次置于70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水，自然干燥玻片。(7)加热玻片至56℃。(8)按照FISH操作步骤进行FISH实验。产前染色体数目检测试剂盒8【变性杂交操作步骤】注意：荧光原位杂交有甲酰胺变性杂交和杂交仪变性杂交两种方法。前者是样本和探针分别进行变性，后者是用杂交仪对样本和探针进行共变性、减少了人为因素的影响。1.甲酰胺变性杂交（手工操作）(1)探针混合物准备及变性•探针配制。室温下将如下液体加入到微量离心管中。（探针、杂交缓冲液使用前必须瞬时离心到管底，以免造成不必要的浪费）(GLP13/GLP21探