融合蛋白表达实验报告

基因构建与表达实验报告实验一目的基因扩增与纯化回收一、聚合酶链式反应实验目的：通过PCR反应将目的片段扩增出来，获得足量的目的片段。实验原理：DNA双螺旋在90-95℃解链形成单链；50-55℃引物与单链结合；70-72℃TaqDNA聚合酶从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5’—3’方向合成新的DNA链。经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。实验仪器和材料：PCR仪PCR管移液器tip枪头实验试剂：双蒸水（ddH2O）10×PCR缓冲液(含Mg2＋)4种10×dNTP混合Taq酶（EasyTaq）DNA模板两种引物（上游和下游）实验步骤：1、配制PCR反应体系试剂ddH2OEasyTaqBufferdNTPEasyTaq酶甘油上游引物下游引物DNA模板100ul大体系6510100.210222注：一般情况下先依次加入ddH2O、10×Buffer、10×dNTP、EasyTaq酶、甘油配体系分装到PCR管中（100ul/管），再加入对应的上下游引物和模板2、放入PCR仪，按照实验设计的温度进行PCR，反应参数如下：(1)94℃预变性4min；(2)94℃变性1min；(3)55℃退火1.5min；(4)72℃延伸2min；(5)重复(2)-(4)30个循环；（6）72℃终延伸10min；二、琼脂糖凝胶电泳检测实验目的：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量的大小，检测目的基因片段是否扩增出来。实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性溶液中带有负电荷，在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。溴化乙锭（EB）可插入到DNA分子的相邻碱基之间，在紫外光的照射下出现荧光，从而指示DNA含量和位置。实验仪器：电泳仪、紫外检测仪、水平电泳槽、移液枪、一次性手套实验试剂：TAE、EB溶液、凝胶加样缓冲液、琼脂糖实验步骤：1、1%琼脂糖凝胶的制备（以制备5块胶为例）：（1）称取琼脂糖1.6g，加入160ml1xTAE缓冲液，在微波炉上加热溶解煮沸熔化，取出摇匀至无沉淀。（2）取有机玻璃内槽，放置于水平位置，用移液枪吸取少量胶将有机玻璃内槽两端密封。冷却到60℃左右（手感温度不烫手即可）加入7ulEB溶液，摇匀后倒入有机玻璃内槽，等距插入5个样品梳子。（3）冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中，加入TAE电泳缓冲液没过胶面。2、加样用移液枪取缓冲液，依次点3ul缓冲液在点样板上，再取PCR样品溶液10ul左右与缓冲液混匀后，加入样品孔中，并记录好点样顺序。（大体系PCR产物需要回收，点样时更换枪头避免交叉污染）3、电泳及结果观察接通电泳槽与电泳仪的电源，170V恒压电泳20min，电泳至溴酚蓝接近胶底部边缘即可；电泳完毕，取出凝胶，放在紫外灯下观察DNA条带的位置，根据DNA条带与溴酚蓝的相对位置估算DNA分子量大小，记录结果。三、DNA片段回收：1、摇匀GS树脂，用移液枪取500ul树脂分装于1.5mlEP管中，将PCR大体系产物加入到GS树脂中，用移液枪吹打混匀，静置10min，让片段结合到GS树脂上2、将混合液转入纯化柱中，13000rpm瞬时离心，弃收集管中液体3、加600ul80%异丙醇洗脱两次，13000rpm瞬时离心，弃收集管中液体，13000rpm空甩20min；取出回收柱放入干净的1.5mlEP管中，放入30-40摄氏度烘箱烘干10min左右，使异丙醇完全挥发。4、取出加入50ulddH2O浸润树脂干粉，静置10min让ddH2O充分浸润树脂干粉，13000rpm离心2-3min，得到的PCR产物用于双酶切。实验结果：序号引物号100ul大体系20ul小体系片段大小1P18279√3272P18280√3393P18281√3784P18282√3215P18283√5526P18284√2317P18285√2228P18286×√3279P18287√50110P18288××52811P18290√47112P18291√35113P18292√18614P19293√64515P18295××87316P18296√61217P18297√24318P18298√41719P18299√90320P18300√24921P18302√28522P18303√30023P18304√30624P18305√34525P18289√18626P18274√489实验二DNA双酶切及酶切产物纯化实验目的：通过DNA限制性内切酶对DNA双链进行双酶切，使DNA片段露出相应的粘性末端。实验原理：1、核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，他们的功能类似动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭，具有自我保护机制。一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，切割DNA分子。在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响酶切反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。2、Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，其优点是：只具有限制性活性，无甲基化修饰活性；对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确；此类酶作用时只需要Mg2+参与，无需ATP。3、DNA双酶切可有效防止载体自连形成空载体，双酶切应选择公用的Buffer实验仪器和材料：PCR仪、PCR管、移液枪、tip枪头、限制性内切酶实验步骤：取5ul通用酶切bufferTango，加入1ul限制性内切酶1和1ul限制性内切酶2，将PCR回收产物全部（大约43ul）加入混匀，体系配好后盖上PCR管并做好编号，放入PCR仪中，设定37℃酶切过夜。用含有GS结合液的树脂纯化酶切产物，操作方法同PCR产物回收方法。序号引物号酶切位点1酶切位点2Buffer1P18279EcoRⅠXholⅠTango2P18286EcoRⅠXholⅠTango3P18292EcoRⅠXholⅠTango4P18299EcoRⅠXholⅠTango5P18280BamhⅠXholⅠTango6P18281BamhⅠXholⅠTango7P18282BamhⅠXholⅠTango8P18283BamhⅠXholⅠTango9P18284BamhⅠXholⅠTango10P18285BamhⅠXholⅠTango11P18287EcorⅠXholⅠTango12P18290BamhⅠXholⅠTango13P18291BamhⅠXholⅠTango14P18293BamhⅠXholⅠTango15P18296BamhⅠXholⅠTango16P18297BamhⅠXholⅠTango17P18298BamhⅠXholⅠTango18P18300BamhⅠXholⅠTango19P18302BamhⅠXholⅠTango20P18303BamhⅠXholⅠTango21P18304BamhⅠXholⅠTango22P18305BamhⅠXholⅠTango23P18289BamhⅠXholⅠTango24P18274BamhⅠXholⅠTango实验三目的基因与载体连接实验目的：将外源DNA片段与线状质粒载体连接，构建具有目的基因的质粒载体。实验原理：在Mg2+和ATP存在下，DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端连接成重组DNA分子。T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；酶-AMP复合物结合到相邻的具有5'磷酸和3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化，形成一个新的磷酸二酯键，将切口封闭。实验仪器与材料：PCR仪、PCR管、移液枪、tip枪头、T4连接酶Buffer、T4DNA连接酶、pet-28a载体、pGEX-4T载体实验步骤1、配制连接反应体系，按顺序向微量PCR管中依次加入：10×T4连接酶buffer1ulT4连接酶1ulPEGX载体/PET28a载体1ul纯化后酶切产物7ul2、体系配好后放置于PCR仪中，22℃保温4h。第一批连接重组22个PGEX-4TE+X18279、18292、18299PGEX-4TB+X18280、18281、18282、18383、18284、18285、18287、18290pet28aE+X18279、18292、18299pet28aB+X18280、18281、18282、18383、18284、18285、18287、18290第二批连接重组24个PGEX-4TB+X18291、18293、18296、18297、18298、18300、18302、18303、18304、18305、18289、18274pet28aB+X18291、18293、18296、18297、18298、18300、18302、18303、18304、18305、18289、18274实验四重组子转化试验目的:将含有目的基因的重组质粒转化入大肠杆菌中。试验原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫做感受态。细菌在0℃CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。细菌处于0℃CaCl2低渗溶液中，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐复合物粘附于细胞表面，经过42°C90S热击处理，促进吸收DNA复合物。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗药性基因表达，即可在含Amp或Kan的培养基中生长。从而筛选出重组子，即带有外源DNA分子的受体细胞。实验仪器与材料：超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、-80℃冰箱、恒温水浴锅胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠(Nacl)、氨苄青霉素、感受态DE3（BL21）、pet-28a载体、pGEX-4T载体、1.5mL离心管、移液枪、试管、培养皿等试剂准备：（1）SOB培养基200ml：蛋白胨4g、酵母粉1g、NaCl0.1g，加水定容至200ml，调节pH7.0（2）LB固体培养基：1%NaCl、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.5%琼脂粉，培养基放入121℃湿热灭菌20min。（3）抗生素：卡那青霉素，氨苄青霉素实验步骤：1、连接完成的重组质粒，在PCR仪中65℃灭活10min2、从-80℃冰箱中取2支感受态细胞，在酒精灯火焰下，分装80ul感受态于1.5mlEP管中，并加入10ul重组质粒混匀，冰浴30分钟。3、于42℃恒温水浴锅中热激90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴5min4、每管加入800ulSOB、16ulGlu、4ulMgCl2，37℃150rpm摇床培养50min。5、8000rpm离心5min，倒掉部分上清，在超净工作台中将吹打混匀后培养物涂布于含Amp或Kan的LB琼脂平板上。6、在37℃培养箱中将平皿倒置，培养过夜12-16h。实验结果：在含氨苄青霉素的培养基上生长的菌落即为含有pGEX-4T重组载体的大肠杆菌，在含卡那青霉素的培养基上生长的菌落即为含有pet-28a重组载体的大肠杆菌。两批实验连接的18304构建Amp和Kan抗性平板上均未长，可能是酶切错误导致。后重新PCR、酶切重连，转化筛选呈阳性，但未表达。实验五重组子筛选和接种实验目的：从单抗菌落中筛选出阳性克隆实验原理：带有目的基因的单克隆菌落在，在高温下（95℃）裂解释放出目的基因的质粒，通过PCR扩增目的基因，从而达到检测的目的。实验仪器和材料：恒温培养箱、PCR仪、电泳仪、紫外检测仪、水平电泳槽、移液枪、一次性手套、LB固体培养基、牙签，PCR扩增试剂等实验步骤：1、取相应抗性的平板，在平板上画格子；配制PCR反应体系2、取出过夜培养的平板，每个菌筛选5个单克隆菌落在平板格子内画线，画线的牙签放入配好的20ul体系中涮洗，涮洗过牙签的体系放入PCR仪中进行扩增，画线的平板放在37℃培养箱中