蛋白质酶解工艺的工业难点-201710

蛋白质酶解工艺的工业难点多酶体系生产工艺相关程序|2017.10Kevin酶解法制取活性多肽，首要在于不能营养物质变质（允许变性）。步骤/程序工业工艺实验室工艺实践认知1.原料储存在大型牲畜加工厂设立冷库基地，检疫，将分离出的骨肉在A分钟内速冷，A℃储存。实验室比较容易降温和恒温。实际上在工业并不容易实现，实验室几乎不用考虑降温时间和维持温度的难易（尤其是成本）工业实现首先是成本，既能维持低温又能节约能耗，这是一个最优的性价比方案。难点在于维系营养成分不能破坏、损失和变质。2.粉粹清洗后，将骨肉粉碎成Acm—Bcm范围内。为了方便对象提取和实验充分，实验室可以粉粹成肉糜状。而不需要承担更多的费用和设备损失。无论何种粉粹设备，粉粹环节对设备造成的损伤是轻易的和频繁的，因而在工业粉粹成肉糜状几无可能，不仅增加成本，对工艺过程也没有太大意义。3.原料配制按牛﹑羊﹑驼不同部位进行配比，棒骨与其他骨头比为A1：B1，骨肉比为A2：B2，牛﹑羊﹑驼品种比为A3：B3：C3。已知，不同动物，不同部位，不同组织，所含蛋白质、多肽和氨基酸迥然不同。为了稳定性（生物医学术语），且为了特定活性物质的存在，有必要进行配比。驼是国家保护动物，直到我做了多年才明白，被CDE等折磨多年。有必要了解动物、部位、组织的活性物质含量，如果运用到医药产品，则必须追求合适配比。4.高温变性蒸煮。在高压罐（容量为A—B吨）内Ckg/㎝2压力，C小时，波美度至少为D。实验室高压设备是非常成熟易用的。维持恒定高压非常正常。工业高温高压恒定比较困难，尤其是罐内各处压力一致，直接影响产物一致性或干物质的收率。工业升压易形成假气压，抽样、副产物（油、渣）分离都是难点。因为需要定时抽样，油进入后序环节要少，渣不能含有效物质。5.酶制剂预配置各种不同类型的酶制剂。计算各种酶用实验室调节PH值及混合非常容易。无论酸碱调节PH值，所用酸碱比较足够的温和，不处理量。浓度、施加速度和搅拌都很轻易。故而酸碱不会损伤酶的活性。能给处理物带来剧烈变化，同时速度要快、时间还要短。工业调整PH和实验室手法迥异，工业需要连续调整（因为不断消耗酸碱而不能得到稳定PH值易见），而不是一步到位。工业需小试测定活性，提前预知干物质量（由浓度经验值得到），最终氨基氮指标≥A。6.固定化酶（可省）酶的固定和固化实验室对固化材料要求不高，因为压力小、液体流速慢工业对固化柱或固化材料要求高，能抵抗温度、速度带来的冲刷、压力的损失。7.酶制剂激活对于需要混合酶，例如胰脏，包含多种酶，不愿意纯化损失多种酶的提取过程。可以粗提使用，但必须提前激活。实验室水浴即可激活。工业用量大，必须保证胰腺的质量和用量。对于规模化生产，胰腺必须提前存储和粗提。工业激活需要大型可通100度热水隔层加热的容器，且搅拌效果好，否则损失酶活性。8.多酶体系碱性酶、中性酶和酸性酶的控制PH和温度的易控制，带来充分反应。工业几乎无法实现，一个简单的加热环节就得几个小时，因此必须利用PH的自降，以及温度与酶的效力中心来反应。生产台时不能超过6—8小时，否则反应物变质。酶的成本很高，因此耗酶量少、反应效力大、生产台时少是工业的追求。9.调节等电点调节等电点至PHA—B。略工业等电点和实验室水平差异较大，原因在与酸碱消耗，需要不断补充，而不是一次到位。10.层析分层，析出略工业耗费大量时间，一个5吨的罐至少需要4小时。11.过滤过滤杂质，提纯实验室很轻易。工业非常难。无论采用何种过滤均会造成结果和速度的困扰。例如超过滤与反渗析，效果好、收率低、耗时长。板式过滤需要多层，效果差、收率一般、时间快。等等。工业需要最优的方案。我们选择浓度低时使用超滤，后期浓度高时使用压力泵滤布过滤。也有时候需要离心。工业的另一个难点在于酶解产物过滤时的动力来源和设置。因为实验室自然而然的过滤在工业不行，没有动力流不动。12.真空浓缩真空浓缩，浓度为A。就保持产物活性而言，实验室浓缩方式多种。工业主要是成本和收率考虑。冷冻干燥固然收率最高，但成本也最高。离心法在规模制造中几无可能。因而真空浓缩，多效连续的方式，是最佳选择。13.反应釜浓缩反应釜持续加热浓缩，浓度为A为干燥目的而持续浓缩，实验室里基本可忽略此步，原因在于实验室干燥目的容易获得。为了节约干燥成本，提高干燥效率和效果，有必要将需干燥物质进一步浓缩，以降低含水量。14.喷雾干燥物料温度为A1；喷雾塔内温度为A2，喷雾塔加热压力为B1、温度为A3；环境温度为A4；高压泵压力为B2、喷速为C；闪喷法直喷液滴（直径D1内）0.2秒、降落液滴（直径D2内）10秒内干燥。实验室最常见为冷冻干燥，效果好，时间可接受。不用考虑工业复杂之情形。工业设备无对应设备，需自制。且根据结果不断调整：喷雾塔必须根据液滴干燥速度、降落时间和落点进行科学设计，以及为提高收率设计串联过滤塔、多效回收装置。鼓风、引风的风量、风速均是关键指标。15.配料根据历史批次的指标，为达到恒定指标，弥补微小差异，不同批次进行振荡混合。实验室无需保证质量稳定性工业产品要达到产品精确标准，必须根据主要指标进行多批次混合，有时也会考虑颜色、粒径、各种营养指标和化学指标的稳定值进行充分混合。16.制剂制造的除湿制剂制造无论何种类型，均需除湿（相对湿度30%）保证。已知蛋白质、多肽或氨基酸物质极易吸潮变质（最快2h）。但实验室无需此步。因为时间短暂而忽略不计。工业制造为连续制造，因而必须保证环境湿度恒定干燥。制剂制造任何一个环节必须保证：环境、设备、器具和相关用料，均为绝对干燥。也包括人与之接触的各方面。关键解释项目说明本项目核心技术有固态化酶系统，多酶体系，分离纯化技术（包括层析技术、密度梯度离心技术、超过滤与反渗析技术等），活性干燥技术（包括高压喷雾技术、活性保持技术、瞬间干燥技术）、生理应用评估系统等。在此主要是围绕多酶体系论述工业与实验室主要差异，以及为了工业目标包括成本、效率、人力等因素的充分调整。生理应用评估系统是根据蛋白质、多肽的临床应用与询证医学应用大数据得出的数据库分析报告，目前共有20余万份患者使用及反馈数据，为国内外唯一一份此方面系统报告。遗憾的是，人生多艰，我制作出此系统15年后，依然由于各种原因没有将此系统应用起来。项目背景过去30年间分离纯化技术的进展，以及检测手段的现代化，大大加快了发现新活性多肽的速度。但是小分子活性肽在工业化水平和临床药物的发展上方兴未艾，无论酶解法或是合成法均存在不同程度的问题：借助于蛋白水解酶生成肽键虽然鼓舞人心，但尚未达到普遍应用的地步；用蛋白水解片断进行的合成，离普遍应用也还有不小的差距。近期的工作重点，应当在结构学、方法学、生理学、工业化应用上取得突破。在酶解法过程中，酶解位置、酶解产物、氨基酸序列分析等均为重要检测方法。本文设定在此我们选用效果比较好的一种模式，也是充分酶解骨肉组织蛋白质，生产小分子多肽和游离氨基酸的模式。这种模式主要有碱性酶、中性酶和酸性酶组成，以此分解各种蛋白质肽键和肽链末端。即使如此，仍然有氨基酸损失，例如酪氨酸。（如需要酪氨酸，需要添加）。第5步酶制剂预处理酶具有特异性，无论使用多少种酶，事实上取决于实验目的。使用何种酶，决定了产物的特定物质多少。纯化酶固然效力、控制准确，但是产物也因为精确而单一效果突出。混合酶效力差，但有效产物种类多，往往营养性作用更大。酶的性质决定酸性产物、碱性产物或接近中性的产物的多寡。因此，要生产出含有符合人体意义的营养模式（例如氨基酸模式），就必须保证酶的种类和准确用量、激活时间、添加时间、作用时间，从而保证产物在要求范围内。第8步多酶体系由于酶解的特异性，PH值的自然下降，故酶的作用时间和效力也均不同，就蛋白酶而言，虽然从大类上看，只有碱性酶、中性酶和酸性酶三大类，实际上至少有5-8种蛋白酶。例如，木瓜蛋白酶和中性酶虽然功能部分重叠，但亦有酶解位置很大不同。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶也是如此。多酶协同，就必须不能彼此降低效能，因此实验室采取一种灭活再加入另外一种的做法。因为精确，反而不能最大程度利用酶的效能。因为酶的活性不是骤高骤低的变化，是曲线。如何在规定时间内，充分挖掘和发挥任何一种酶的活性和效力，是工业多酶反应并行或串行的经验考量。也是成本与科学的反复平衡。