基因工程的基本工具

设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。基因工程的概念•基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达实质基因重组结果人类需要的基因产物基础理论和技术的发展催生了基因工程•DNA是遗传物质的证明•DNA双螺旋结构和中心法则的确立•遗传密码的破译•基因转移载体的发现•工具酶的发明•DNA合成和测序技术的发明•DNA体外重组的实现•重组DNA表达实验的成功•第一例转基因动物问世•PCR技术的发明基础理论技术发明问题探讨：苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉为什么能把苏云金芽孢杆菌的基因“嫁接”到棉花上并成功表达？1、所有生物的的DNA都是以4种脱氧核苷酸为基本单位，构成独特的双螺旋结构，这为不同生物DNA拼接提供了物质基础。2、地球上的所有生物共用一套遗传密码。•基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)•上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？重组DNA导入形成•解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶关键步骤一：从苏云金芽孢杆菌细胞内提取抗虫基因关键步骤二：抗虫基因与运载体“缝合”成重组DNA关键步骤三：将抗虫基因导入棉花细胞“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1.1、DNA重组技术的基本工具一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”分布：作用特点：切点：结果：举例：形成两种末端：黏性末端或平末端主要在原核生物中特异性（专一性），即识别特定核苷酸序列，切割特定位点磷酸二酯键EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开•末端类型：一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”伸出的核苷酸之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端限制酶在原核生物中的作用•原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。•含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。•要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切2个切口，产生4个黏性末端。•如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，可以合成重组的DNA分子。讨论：分子缝合针：DNA连接酶GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG用同种限制酶切割DNA连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，生成磷酸二酯键，使之成为一个完整的DNA分子。二、DNA连接酶——“分子缝合针”CTTAAGAATTCG可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点寻根问底•DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板酶的种类作用底物作用实质形成产物限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA解旋酶与DNA几种有关的四种酶DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子切断磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键断开碱基对之间的氢键DNA片段(平末端或黏性末端）重组DNA分子与亲代DNA分子相同的DNA分子形成单链DNA运载体的作用：携带目的基因进入受体细胞，使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达。三、基因的运载体——“分子运输车”能否用SARS病毒作为基因载体？作为载体，若没有切割位点将怎样？携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？从化学组成看，载体应含有什么成分？双链DNA不能不能进行DNA重组载体上应有标记基因可能造成基因丢失运载体必须具备的条件：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）4、对受体细胞无害运载体的作用：携带目的基因进入受体细胞，使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达。常用的运载体有：质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等三、基因的运载体——“分子运输车”最常用的运载体——质粒分布：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中;最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。本质：细胞染色体(或拟核)外能自主复制的小型环状DNA分子。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。基因的运输工具——质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。抗四环素基因重组DNA四环素生长被抑制正常生长四环素1、基因工程为什么分四个步骤？预习1.2：2、基因库、基因文库、基因组文库、部分基因文库、cDNA文库的区别？3、PCR反应的过程，三个温度；4、基因表达载体各部分的作用；