球形细胞脑白质营养不良的临床特点及基因突变分析-郑纪鹏

中国实用儿科杂志2014年5月第29卷第5期论著文章编号：1005-2224（2014）05-0367-06DOI：10.7504/ek2014040112球形细胞脑白质营养不良的临床特点及基因突变分析郑纪鹏1，盛慧英1，黄永兰1，赵小媛1，刘鸿圣2，毛晓健1，李秀珍1，刘丽1摘要：目的探讨球形细胞脑白质营养不良（Krabbe病）患儿的临床、影像学和酶学特点及GALC基因突变特征。方法采用荧光底物法检测外周血白细胞β-半乳糖脑苷脂酶（GALC）活性，回顾分析2010年6月至2012年12月广州市妇女儿童医疗中心来自不同家系的3例Krabbe病患儿的临床、影像学特点。应用RT-PCR及直接测序法进行GALC基因突变分析。结果3例Krabbe病患儿，其中男2例，女1例，年龄3个月至40个月，临床分型婴儿型1例，晚发婴儿型2例。因“哭闹、抽搐或精神运动发育倒退等”就诊，头颅MRI提示双侧内囊后肢或脑白质对称性异常信号影，磁共振波普成像（MRS）提示N-乙酰天门冬氨酸/肌酐（NAA/Cr）比值下降，胆碱/肌酐（Cho/Cr）比值升高。外周血白细胞GALC酶活性0～0.2nmol/（mg·17h）［正常参考范围18～75nmol/（mg·17h）］。GALC基因突变分析发现2个已知致病突变p.S68F、p.R531H，3个新错义突变p.D46Y、p.G59S、p.P154H。随访18个月，死亡2例，病情进行性加重1例。结论Krabbe病患儿主要临床表现为激惹、抽搐、精神运动发育迟缓或倒退。起病越早，进展越快。头颅MRI表现双侧对称性脑白质或内囊后肢异常信号应高度怀疑Krabbe病，白细胞GALC酶活性测定及GALC基因突变分析有助确诊。关键词：球形细胞脑白质营养不良；Krabbe病；影像学；β-半乳糖脑苷脂酶；GALC基因中图分类号：Ｒ72文献标志码：ATheclinicalfeaturesandmoleculargeneticassayofgloboidcellleukodystrophy（Krabbedisease）.ZHENGJi-peng，SHENGHui-ying，HUANGYong-lan，ZHAOXiao-yuan，LIUHong-sheng，MAOXiao-jian，LIXiu-zhen，LIULi.TheGuangzhouWomenandChildren’sMedicalCentre，Guangzhou510623，ChinaAbstract：ObjectiveToexploretheclinical,radiologicalandemzymicfeaturesandgenemutationfeaturesofGALCgeneinchildrenwithKrabbedisease.MethodsTheclinical,radiologicalandemzymicfeaturesof3unrelatedchildrenwithKrabbediseaseintheGuangzhouWomenandChildren’sMedicalCentrefromJun.2010toDec.2012wereretro⁃spectivelyreviewed.Thegalactocerebrosidaseactivityinleukocyteswasdetectedbyfluorescentsubstratemethod.ThemutationanalysisofGALCgenewasperformedbyRT-PCRanddirectsequencing.ResultsThreeindexcasesweredi⁃agnosedatagesrangingfrom3～40monthsafterbirth.Theywere1femalewithinfantileformand2malewithlate-in⁃fantileform.Theywereadmittedtoourhospitalforcrying，irritation,convulsion,psychomotorretardationorregression.BrainMRIshowedsymmetricsignalchangesintheposteriorlimboftheinternalcapsuleandtheperiventricularwhitematter.MRSrevealedareductionoftotalN-acetylaspartate（neuroaxonalmarker）aswellasstronglyelevatedinositol（glialmarker）inwhitematterandtheposteriorlimboftheinternalcapsule.Thegalactocerebrosidaseactivitiesofthe3patientswereremarkablylow，rangingfrom0～0.2nmol/（mg·17h）protein（normalrange18～75）.Fivedifferentmuta⁃tionswereidentified,three（p.D46Y，p.G59Sandp.P154H）ofwhichwerenovelintheGALCgene.Followedupfor18months，2casesdiedandonebecamemoreseriousprogressively.ConclusionTheclinicalfeaturesofKrabbediseaseareirritability，convulsion，psychomotorretardationorregression.Theearliertheonset，thefastertheprogress.ItshouldbehighlysuspectedwhenbrainMRIshowssymmetricwhitematterchanges.ThetestofgalactocerebrosidaseactivityandthemoleculargeneticassayofGALCgenecanconfirmthedefinitediagnosisofKrabbedisease.Keywords：globoidcellleukodystrophy；Krabbedisease；imageology；galactocerebrosidase（GALC）；GALCgene作者单位：广州市妇女儿童医疗中心1.内分泌代谢科2.影像科，广东广州510623通讯作者：黄永兰，电子信箱：[e-mail]球形细胞脑白质营养不良（globoidcellleuko⁃dystrophy，GLD）又称Krabbe病，是由于β-半乳糖脑苷脂酶（galactocerebrosidase，GALC）基因缺陷导··367ChineseJournalofPracticalPediatricsMay.2014Vol.29No.5致溶酶体内GALC酶缺乏，半乳糖脑苷脂蓄积在中枢神经和周围神经系统引起的一系列临床表现［1］，是一种罕见的溶酶体贮积病，呈常染色体隐性遗传。国内报道较少［2-3］。为提高临床医师对本病的认识，现将我院确诊的3例Krabbe病患儿的临床表现、磁共振成像（MRI）、磁共振波谱成像（MRS）及GALC基因突变分析结果报告如下，并作相关文献复习。1资料与方法1.1对象2010年6月至2012年12月广州市妇女儿童医疗中心内分泌代谢科对330例以惊厥、精神运动发育迟缓、精神运动发育倒退等神经系统异常患儿进行了Krabbe病高危筛查，经外周血白细胞GALC酶测定确诊Krabbe病3例，其中男2例，女1例，诊断年龄3个月至40个月，临床分型婴儿型1例，晚发婴儿型2例。3例患儿均进行血常规、尿常规、血气分析、血电解质、血氨、血糖、血乳酸、肝肾功能、肌酸激酶、血浆酰基肉碱谱及氨基酸分析、尿GC-MS有机酸分析等检查，均未见明显异常。外周血白细胞β-半乳糖苷酶、氨基己糖苷酶A、氨基己糖苷酶A&B、芳基硫酸脂酶A酶活性均未见异常，排除了GM1、GM2神经节苷脂沉积症及异染性脑白质营养不良（MLD）。1.2方法1.2.1影像学检查包括头颅MRI及MRS。1.2.2GALC酶测定依据参考文献［4］建立GALC酶测定方法，底物6-hexadecanoylamino-4-methylumbelliferyl-Beta-D-galactoside（HM-βGal）购自荷兰moscerdan公司，底物缓冲液为0.2mol/L磷酸盐/0.1mol/L枸橼酸（pH5.2）。取EDTA抗凝外周血4mL，右旋糖酐法分离白细胞，超声破碎制备细胞匀浆，BCA法测定蛋白浓度。取白细胞匀浆10μL（15μg蛋白），加0.4mmol/LHMU-βGal混匀，37℃孵育17h，加0.5mol/L碳酸氢钠/0.5碳酸钠缓冲液（pH10.7）终止反应；Bio-TekFLx800荧光分析仪测定游离HMU荧光强度，激发光波长350nm，发射光波长460nm，以HMU为标准计算酶活性，单位以“nmol/（mg·17h）”表示，当GALC活性较正常对照组明显降低（低于均值的10%）时，重新采样重复检测1次确认。1.2.3GALC基因突变分析参考序列Gen⁃BankNM_000153.3，NP_000144.2，采用RT-PCR方法进行GALC基因突变分析。提取外周血总RNA，反转录为cDNA，应用软件PrimerPremier5根据GALC基因cDNA序列设计5对引物（表1），扩增GALC基因所有外显子编码序列，通过直接测序进行基因突变分析，发现突变者反向测序确认。突变于人类基因突变数据库（HGMD）及千人基因组数据库（1000Genomes）查看是否已报道，对新突变进行不同物种间保守性分析，并应用“Polyphen、MutationTasting”软件进行蛋白功能预测。表1GALC基因PCR引物、扩增片段长度片段上游引物（5’-3’）下游引物（5’-3’）PCR产物长度（bp）1CTGCCCGTATCTATCGTGGCGTCTGTTGTCTGCCCATC3992GGCAACCTCCCGACTTCTACTTCTTCCCAGTCAACTTTGC6133GAGTGAAAATCATAGCAAGTGAAGGTGGCAAATTGTTGTG5744GCTCTGACTGATGGCTTAGCACCTTTATTTACTCTTCCTG6435GACTACAACTGGACCAATCTGACGTTACTGCCATCTACAGGACC7581.2.4治疗及随访3例患儿确诊后均给予对症支持治疗，因为患儿确诊有先后，从第1例确诊至2013-10-11随诊了18个月,均电话随访。2结果2.1病例特点例1婴儿型，为生后3个月女婴，因“哭闹不安半月，抽搐1次”入院，抽搐主要表现为头后仰，双眼凝视，持续约5min自行缓解。查体巴氏征（+），余未见明显异常。晚发婴儿型2例，其中例2为13月龄男性患儿，例3为40月龄男性患儿，均因“精神运动发育倒退”就诊。例2于生后11个月出现行走缓慢，快速进展为不能独站、独坐、抬头不稳，查体坐位呈前倾拱腰姿势，双膝腱反射（++），右侧踝阵挛（+），右侧巴氏征（+）。例3于生后30个月始运动发育减慢，渐发展为走路不稳，易摔跤、上楼梯困难，查体双膝反射稍活跃，··368中国实用儿科杂志2014年5月第29卷第5期肌力及肌张力稍降低。例1、例2行脑干诱发电位均提示双侧听阈降低，例2行神经传导速度测定示双侧正中神经、双侧尺神经及腓总神经传导速度均减慢。3例患儿均无类似家族史，父母非近亲结婚。2.2头颅MRI3例患儿均可见双侧内囊后肢对称性异常信号影；例1尚可见双侧放射冠异常信号影，结合CT考虑为钙盐沉积；例2、例3可见侧脑室前后角旁白质、半卵圆中心、大脑半球深部白质对称性不规则片状异常信号（图1）。a.例1T