植物的器官培养

第六章植物的器官培养【学习目的要求】1．一般掌握离体根培养的取材部位和培养基的选择。2．掌握茎尖培养的种类和操作步骤。3．掌握茎段培养中材料的选择、处理及培养基的调整。4．掌握离体叶片的培养步骤。5．一般掌握胚胎培养的类型与各自的注意事项。6.掌握如何防止培养过程中外植体的褐化和玻璃化。7.掌握植物器官组织培养常见问题的原因及对策【主要内容】第一节营养器官培养一、离体根培养二、茎尖培养三、茎段培养四、离体叶培养第二节生殖器官培养一、花器官和种子培养二、胚胎培三、胚珠培养第三节植物器官组织培养常见问题及对策第一节营养器官培养一、离体根培养㈠离体根培养特点：因为根系生长快，代谢强，变异小，加上无菌，不受微生物干扰，可根据研究需要，改变培养的成分来研究其营养吸收、生长和代谢的变化。㈡应用：研究根系生理和代谢变化；也可由根细胞再生成植株，不仅证明根细胞的全能性，也产生了无性繁殖系，用于生产实践。一、离体根培养㈢培养方法：1．培养基用无机离子浓度低的White培养基，也可用MS、B5等，但浓度为2/3或1/2。White培养基配方为：硝酸钾80，硫酸镁720，硫酸锰7，硫酸铜0.03，碘化钾0.75，Vpp0.5,VB60.1,VB10.1,甘氨酸3(mg/L)一、离体根培养2．无性系的建立和培养、应用1)将种子进行表面消毒，在无菌条件下用湿布培养萌发，至根伸长1.0cm以上。2)从根尖一端切取长1.2cm的尖端，接种于培养基中。3)培养物生长甚快，几天后发育出侧根。待侧根生长约一周后，即切取侧根的根尖进行接种培养，如此反复，得到离体根的无性系。4)这种根可用来进行根系生理生化和代谢方面的实验研究。如营养选择吸收、根尖伸长生长、生长素对伸长的影响等5)培养条件为暗光、25～27℃。3．植株再生培养第一步诱导形成愈伤组织。第二步在再分化培养基上诱导芽的分化、再分化成小植株。二、茎尖培养㈠概念：是切取茎尖部分或茎尖分生组织部分，进行培养的过程。这是组织培养中用得较多的外植体。因为茎尖分生区是三个分区的主要部分。㈡茎尖培养可分为微茎尖培养和普通茎尖培养。1.微茎尖：指带有1-2个叶原基的生长锥，其长度不超过0.5mm。2.普通茎尖：指取几mm到几十mm长的顶芽尖及侧芽尖。这里主要介绍后者㈢特点：技术简单，操作方便，易成活和分化，成苗时间短。㈣步骤如下：1．取材：挑选洁净、无污染，生长不久的茎，从植物的茎、藤或匍匐枝上切取2cm以上的顶梢。木本植物可事先对茎尖喷几次灭菌药剂。用于普通茎尖培养。2．消毒将采到的茎尖切成0.5～1.0cm长，并将大叶除去，休眠芽预先剥除鳞片。将茎尖置于流水冲洗干净，再在95%的酒精中处理30秒，然后在稀释20倍的次氯酸钠中浸5～８分钟，最后用无菌水冲洗数次，沥干后准备接种。3．接种为了减少污染，在接种前再剥掉一些幼叶，使茎尖为0.5cm大小左右。用作快速繁殖。注意：一要防褐化。接种时，不用锈刀，动作敏捷，随切随接，用1～5%VC液浸泡处理。二要防干燥4．培养（1）培养基：采用MS培养基或略加修改，或补加其它物质。也可用其它培养基如White,Heller等。培养基中生长素是必须的，如2,4-D，IAA,NAA等，但是浓度不能太高，一般用0.1mg/L左右，若高易产生畸形芽或形成愈伤组织。（2）培养问题处理：茎尖在培养过程中会出现生长太慢、生长太快和生长正常等三种类型。I生长太慢：接种后茎尖不增大，只是茎尖逐渐变绿，出现绿色小点，细胞逐渐老化而进入休眠状态，或者逐渐变褐死亡。引起原因的是生长素浓度太低，或是温度过低或过高。（2）培养问题处理：II生长太快型：是接种后茎尖迅速增大，在茎尖基部产生愈伤组织，并迅速增殖，而茎尖不伸长，久之茎尖也形成愈伤组织，从而丧失发育成苗的能力。引起原因一是生长素浓度过高，引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组织的形成。二是光照太弱或温度太高。（2）培养问题处理：III生长正常型是接种后茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色逐渐变绿，并逐渐伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形成小苗。（3）培养条件：培养时每天光照可长一些，最长达16h/d，照度1500-3000Lx，温度25±2℃。并且根据不同植物种类，或者随培养过程的不同，给予适当的昼夜温差等处理。注意：防培养基干燥，由于茎尖培养时间较长，通过定期转移、严加封口等。一般茎尖培养在４０天左右可直接长成新梢。（4）继代培养用茎段切割法。继代培养可用MS0培养基。或用生长物质较低的MS培养基。也可边增殖边生根培养（5）诱导生根I）用1/2MS培养基，并只加入生长素类调节物质，如NAA、IBA等。注意浓度II）也可将切下的新梢基部浸入50或100ppm的IBA溶液处理4～8小时，然后转移到无激素的生根培养基中。III）注意较高浓度的生长素对生根有抑制作用。5.移栽驯化⑴指标：发现新梢基部生有较浓密的不定根，生长健壮而发达，长度在1cm以内。⑵移栽：可先进行几天炼苗程，取出→洗培养基→栽入驯化器皿—基质蛭石：珍珠岩：草炭土为1:1:0.5。⑶栽后管理：1)初期保持湿度。基质浇透水，床面浇湿，搭小拱棚等，并且初期要常喷雾处理。2)后期逐渐减少湿度。拱棚两端打开通风，减少喷水次数。以后揭去拱棚，并控制水分。⑷温度管理上要掌握适宜的生根温度，最适宜的温度是16～20℃，春季地温较低时，可用电热线来加温。光照：初期弱光照，加盖遮阳网或报纸等，后期可直接利用自然光照。移栽前的工作（1）培养瓶生壮苗加入生长控制剂，如多效唑，B9，CCC，其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。（2）炼苗将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为10—30D。移栽时应注意的问题（1）防止菌类滋生①苗底部培养基要洗干净②杀菌剂处理苗的根部③定时用杀菌剂处理种植基质常用杀菌剂：KMnO4、百菌清、多菌灵、托不津，使用浓度0.1％（2）保持小苗水分供给平衡（3）移栽时选择合理的种植基质基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭。泥炭珍珠岩椰糠(4)注意一定光照，温度条件一般强度较高的慢射光较好三、茎段培养概念：指不带芽和带1个以上定芽的，包括块茎、球茎在内的幼茎切段的无菌培养。培养目的：快速繁殖。也可研究茎细胞的生理，以及筛选突变体育种。快繁优点：培养技术简单易行，繁殖速度较快；芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖植物的快速繁殖问题等。1.材料选择和处理取生长健壮无病虫的幼嫩枝条或鳞茎盘，木本则取当年生嫩枝或一年生枝条,剪去叶片，剪成3～4cm的小段。注意：1）尽力取顶部茎切段和顶芽，但由于顶芽少可利用腋芽，但尽力用茎上部的腋芽。2）尽量在生长期取芽，休眠期成活率降低。如苹果在3～6月取材的成活率为60%，7～11月下降到10%，12～2月都在10%以下。1.材料选择和处理在自来水中冲洗1～3小时，用75%酒精灭菌30～60秒，再用0.1%升汞浸泡3～8分钟，或用饱和漂白粉浸泡10～20分钟，因材料老嫩和蜡质多少而定时间。最后用无菌水冲洗数次，以备接种。2．培养过程培养选MS培养基，加入3%蔗糖，用0.7%的琼脂固化。培养条件保持25℃左右，给予充分的光照和光期。培养物的变化：1）基部切口上长出愈伤组织，呈现稍许增大，控制不要过大。2）而芽开始长长，有时会出现丛生芽，培养方式或是培养出芽梢或是培养芽丛，从而得到无菌苗。培养基：促进腋芽增殖用6-BA是最为有效的，依次为Kt和Zt等。生长素虽不能促进腋芽增殖，但可改善苗的生长，也要适量加入。GA对芽伸长有促进作用。2．培养过程继代扩繁：包括二种途径，一是促进腋芽的快速生长；二是诱导形成大量不定芽。第一种途径的好处是不会产生变异，能保持品种优良特性。且方法简便，可在各种植物上使用，每年从一个芽可增殖10万株以上。第二种途径虽会产生变异，繁殖系数较高，适于多数植物。生根培养和移栽驯化与茎尖培养相似，不再重复。同样注意驯化管理。要进行炼苗，小心移栽，初期湿度要大，基质通气湿润，保湿保温，特别要精心管理等。四、离体叶培养离体叶培养:包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。它大多经脱分化形成愈伤组织，再经再分化生出不定芽和不定根。应用：不仅可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题，而且也是繁殖稀有名贵品种的有效手段四、离体叶培养叶培养特点：材料来源广泛，数量大，容易培养，尤其对木本植物，生成的愈伤组织完整，数量多，较迅速等。叶片再生能力：以羊齿植物最多，双子叶植物次之，单子叶植物最少。再生方式：一种是直接诱导形成不定芽，另一种是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化成植株。叶的离体培养技术如下：１．材料选择及灭菌选择健康洁净的植株，取其较幼嫩叶片，冲洗干净，用70%酒精漂洗约10秒，再在饱和漂白粉液中浸3～15分钟，或在0.1%升汞中浸3～5分钟，以前者为佳。用无菌水冲洗数次，再放在无菌的干滤纸上吸干水分，以供接种用。对一些粗糙或带茸毛的叶片要延长灭菌时间。注意要选择成熟的叶片。叶的离体培养技术如下：２.接种将叶片切成约0.5cm见方小块或圆片及薄片（如叶柄和子叶），注意选择切块位置。MS培养基附加BA1～3，NAA0.25～1。3.培养培养条件为每天10～12小时光照，光强1500～3000Lx。3.培养1）培养2－4周，叶切块开始增厚肿大，进而形成愈伤组织。2）转移到分化培养基上进行培养，其培养基的BA含量为2左右，约再过10天左右，愈伤组织开始转绿出现绿色芽点，形成不定芽。通过继代培养和生根培养，完成整个组培过程。3.培养叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大。首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易培养。其次要添加适当的生长素和细胞分裂素浓度，保证利于叶组织的脱分化和再分化。第二节生殖器官培养一、花器官和种子培养（一）花器官培养花器官培养：指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。子房和花药培养另有专门叙述。应用：理论上通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用。可以了解花器各部分对果实和种子发育的作用，以及内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用。生产上可用于珍贵品种的扩大繁殖。培养方法如下：1．取材从健壮植株上取未开放的花蕾，已经开花的不宜用，因为消毒困难。先用75%酒精消毒约30秒钟，再用饱和漂白粉浸10～15分钟，取出用无菌水冲洗数次。2．接种培养用整个花蕾培养时，只要把花梗插入培养基中。若用花器，则分别取下切成小片。2．接种培养I)培养基：MS、B5等。若让花器官育成小植株，要用诱导培养基，加入生长激素和细胞分裂素，先形成愈伤组织或胚状体，再分化培养成植株。如菊花的花瓣片接在含6-BA2mg/L、NAA0.2的MS培养基上，形成少量愈伤组织。再经1个月就分化出绿色芽点，再切割转接，可形成大量无根苗，用于繁殖。II)26℃1500Lx光照，每天光照10小时，培养约2周（二）种子培养种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成熟种子的无菌培养。这项技术广泛地应用于花卉、蔬菜、果树、农作物等的种子培养之中。优点：可以打破种子休眠，特别对一些休眠期长的植物；可以作为大量生产试管苗的好材料，它分化容易，无菌操作方便。可使远缘杂交产生的杂种败育种子，正常萌发产生第二代植株。培养技术如下：1．种子灭菌种皮厚或不饱满的种子，宜用0.1%升汞消毒10～20分钟。幼嫩的或发育不全的种子，宜用饱和漂白粉消毒15～30分钟。若种子上有绒毛或蜡质，应先用95%酒精或吐温40处理，提高消毒效果。对壳厚难萌发的种子，可去壳培养。培养技术如下：2．培养基若以种子萌发为目的，培养基可不加或少加生长激素。对某些发育不全的无胚乳的种子培养，应提供适当的生长激素。种子培