现代显微成像技术综述

龙源期刊网现代显微成像技术综述作者：张祥翔来源：《光学仪器》2015年第06期摘要：概述了光学宽视场显微镜、共聚焦显微镜、超分辨率显微镜中所应用的现代显微成像技术，对各种传统和先进的显微成像原理进行了总结。光学宽视场显微镜最常用的显微技术有明场成像、暗场成像、相衬成像、偏光成像、微分干涉（DIC）成像、调制对比成像和荧光成像。相衬成像中根据不同的成像结构还有切趾相衬成像。微分干涉除了传统的偏振光照明还有圆偏振光照明（CDIC）和专用于塑料的微分干涉（PlasDIC）。共聚焦显微镜随着计算机技术和制造技术的发展而有了巨大的发展。除了传统的共聚焦荧光显微镜以外，还有连续反斯托克斯拉曼散射（CARS）共聚焦、多光子共聚焦和白光共聚焦。超分辨率显微镜中主要介绍了受激辐射淬灭（STED）技术和紧随基态淬灭显微技术的单分子返回（GSDIM）技术。关键词：宽视场显微镜；共聚焦显微镜；超分辨率；显微成像技术中图分类号：O435文献标志码：Adoi：10.3969/j.issn.10055630.2015.06.017Abstract：Theimagingtechnologyinmodernmicroscopeforwidefieldmicroscope，confocalmicroscopeandsuperresolutionmicroscopeisoutlinedhere.Themostfrequentlyusedtechnologyinthewidefieldmicroscopeisbrightfield，darkfield，phasecontrast，polarization，DIC，modulationcontrastandfluorescence.Inphasecontrast，thereisalsoapodizedphasecontrast.Inaddition，DIC，CDICandPlasDICarealsopresented.Confocalmicroscopeisdevelopedgreatlywiththedevelopmentofcomputerandmanufacturetechnology.Besidesconventionalconfocalsystem，theprincipleofcoherentantiStokesRamanscattering（CARS）confocal，multiphotoconfocal，whiteconfocalarealsoexplainedindetail.Asforsuperresolutionmicroscope，theprincipleofstimulatedemissiondepletion（STED）andgroundstatedepletionmicroscopyfollowedbyindividualmoleculereturn（GSDIM）areclarified.Keywords：widefield；confocal；superresolution；microscopeimagingtechnology引言显微镜根据成像方式可以分为光学宽视场显微镜、共聚焦显微镜、体视显微镜[1]。光学宽视场显微镜和共聚焦显微镜更多地应用于生命科学研究，对成像的要求更高，而体视显微镜更多应用于工业领域，对数码化和人性化的要求更高[2]。本文主要阐述用于生命科学领域的显微成像技术，光学宽视场显微镜常用的显微技术有明场成像、暗场成像、相衬成像、偏光成像、微分干涉（DIC）成像、调制对比成像和荧光成像，共聚焦显微镜常用的显微技术有荧光、全反射、超分辨、多光子和白光共聚焦成像。1光学宽视场显微镜龙源期刊网在光学宽视场显微镜中的各种成像技术中，明场、暗场、偏光和荧光成像是为了使需要观察的标本结构可见，而相衬、微分干涉、调制对比成像是将标本结构中的相位变化显现出来。很多情况下几种成像技术同时使用。1.1明场成像和暗场成像明场成像是最基本的显微成像技术，其他所有的成像技术都是以明场成像为基础的。明场成像光路如图1所示，光源通过集光镜和聚光镜聚焦到标本上，如果是临界照明，灯丝的像直接会聚到标本；如果是科勒照明，灯丝像会聚在聚光镜前焦面，由聚光镜再照射到标本上。透射过标本的光线由物镜收集在物镜后焦面上形成光瞳的像，光瞳的像是相对于空间的成像光线角度的分布，现代显微镜中多用这个位置进行各种对比方式的变化。经过后焦面后，光线进入镜筒透镜，镜筒透镜将相对于空间的角度分布变换为相对于空间的位置分布，即在镜筒透镜的后焦面形成中间像面。现代显微镜中，在镜筒透镜形成中间像面之前，会利用Cmount镜头转接中间像面到摄像头上，从而实现数码成像，便于现代教学和研究。最后中间像面由目镜成像到眼睛的视网膜上，从而看到放大的像。暗场成像和明场成像只有照明光路有所区别。暗场成像是以超出物镜数值孔径的角度照明，标本由于大角度照明产生衍射光或者散射光，包含在物镜数值孔径内的衍射光或者散射光由物镜收集，按照明场光路投射到眼睛或者摄像头。暗场照明如图2所示，有两种方式：一种是透射式暗场照明，直接用中间不透光的圆环在聚光镜前焦面拦截光线；另一种是反射式暗场照明，暗场反射镜面安装在物镜外壳靠近标本的位置，光线经过暗场反射镜面以超出物镜数值孔径的角度入射在标本上，标本发出的衍射或者杂散光由物镜收集后成像。反射式暗场照明镜面有的是球面，有的是非球面，有的在照明光路中加上微透镜或者散射片，都是为了实现大面积均匀照明。1.2相衬成像相衬成像光路如图3所示。相衬成像是在物镜后焦面或者后焦面的共轭位置，也就是光线角度相对于空间分布的位置（光瞳位置），选取某一环带的光线，将通过这一环带0级光线强度降低到和1级衍射光相同，再将0级光线的相位改变180°，和1级衍射光的相位相反。这样当光线在光瞳面进行相位和强度变换后，镜筒透镜将其按照空间位置合成，在中间像面就会凸显出由1级衍射光所表征的结构特征，同时由于0级光变弱，背景将比较暗。不同级次的衍射光在经过标本（类似光栅的作用）后分开，0级衍射光经过物镜中的相衬环后强度和相位发生了变化，物镜相衬环的宽度小于某种特征结构产生的衍射角对应的宽度，这样该0级光对应的1级衍射光可以保持强度和相位不变。介于这个角度之间的特征结构，1级衍射光会有部分产生强度和相位的变化，在和0级衍射光合成的时候就会产生光晕，而且角度越小，光晕的影响越大，这是相衬成像的缺点。一般会根据经验找到一个合适的相衬环宽度，光晕和成像细节平衡得比较好。龙源期刊网正是由于相衬成像的这种特点，只有某种结构的相位变化可以通过相衬成像反映出来。一般是通过相衬成像较易反映细胞内部结构，但不易反映细胞的边界。其他结构，特别是以上提到的小角度的结构，都或多或少的有一些光晕产生。Nikon公司采用了切趾相衬成像的方法，将小角度的光线透过率进一步降低，小角度的光线对应于大尺寸的结构，也就是非精细结构的强度降低，同时大角度的光线对应于小尺寸即精细结构更容易显现出来。1.3偏光成像偏光成像顾名思义就是用偏振光进行成像。偏光成像分为正交偏振和锥光偏振两种，光路如图4所示。正交偏振是指经过起偏器的线偏振光经过聚光镜、标本、物镜后，标本的偏振特性会使原来的线偏振光的振动方向发生变化，只有垂直于原来线偏振光振动方向的偏振光可以通过后面的验偏器，从而被目镜接收。正交偏振是直接用目镜观察的偏振成像方式。另外一种锥光偏振是指用勃氏镜和目镜直接观察物镜后焦面的偏振光成像，其余和正交偏光相同。由于观察的是物镜后焦面的成像情况，相当于观察的是标本面上光线的角度随空间变化的情况，所以称之为锥光偏振。锥光偏振一般配合大数值孔径的物镜使用。偏光成像在生命科学领域的应用较少，主要用于地质材料科学研究中。1.4微分干涉成像微分干涉也是将标本的相位差转化为振幅变化后进行成像，这一点和相衬成像相同。但是微分干涉只对0级光进行调制，而相衬成像对0级光和1级光进行调制。图5为微分干涉成像光路图。在明场成像的基础上，聚光镜前焦面上放置起偏器和渥拉斯顿棱镜。线偏振光被分为寻常光o光和非寻常光e光，它们的振动方向成90°。o光和e光在标本上通过聚光镜会聚，标本的双折射性能或者相位偏差会对o光和e光的相对振动方向产生影响，也就是o光和e光不再是相互90°的振动方向，或者o光或者e光有了微小的相位差。标本的相位信息带入光路中，再通过第二块渥拉斯顿棱镜，使o光和e光具有相同的振动方向，这样带有相位差的o光或者e光就会进行干涉，相位的变化则转换为振幅的变化。但是有一些光由于振动方向的变化在经过第二块渥拉斯顿棱镜后没有干涉，变成杂散光，于是就需要验偏器选择进行干涉，而且垂直于入射光偏振方向的光进入镜筒透镜和目镜。实际应用中渥拉斯顿棱镜都换为诺玛斯基棱镜，可以保证合适的工作距离。由于o光和e光是渥拉斯顿棱镜分出的两束不同位置的光，也就是o光和e光都会分别成像，它们由第二块渥拉斯顿棱镜合成的时候，由于棱镜的位移作用，所成的像会在X和Y向有所位移，产生浮雕的效果。故如果调解渥拉斯顿棱镜的相对位置，则可调解浮雕效果。微分干涉先是微分然后是干涉，先把相位变成了相位的变化（即相位差），再将相位差通过干涉变成振幅变化，而相衬成像中直接把反应结构的相位通过降低背景光的方法显现出来龙源期刊网（本质上也是干涉）。因此微分干涉容易将细胞的边界显现出来，因为边界上对o光和e光的相位变化较大，而内部的连续介质对o光和e光的相位变化就较小。但是相衬成像直接将相位显现出来，所以通常是内部的精细结构具有更大的相位角，更容易通过相衬方法显现出来。微分干涉对相位差的依赖既是其优点，也是其缺点。特别是在线偏振光情况下，只有和偏振方向相同的相位差才能显现。Zeiss采用圆偏振光（CDIC）[3]后，各个方向的相位差都有所显现，较好地平衡微分干涉和偏振。普通微分干涉还需要特殊的物镜，只能在很小的焦深内实现较好的微分干涉的效果，并且只适用于培养皿为塑料的标本。这些都对微分干涉的应用产生了限制。Zeiss在专利DE10219804和文献[2]中提供了一种PlasDIC的微分干涉方式[4]，而且已经成功商用。只需要一个偏振片和渥拉斯顿棱镜就可以实现DIC效果。而且只需要普通物镜，培养皿为塑料的标本也适用。但是在聚光镜前必须使用狭缝，物镜数值孔径也不能过大，因此仅小于40X物镜可用。仅有的一对渥拉斯顿棱镜和验偏器放在物镜和镜筒透镜之间，非偏振光只有在经过物镜和该渥拉斯顿棱镜之后才变成偏振光并分为o光和e光，由于是平行于渥拉斯顿棱镜的狭缝照明产生的光，所以这里的o光和e光也是相差90的振动方向。同时由于o光和e光已经经过了标本，出现了相位差，所以在验偏器使o光和e光在同一振动方向时，就发生了干涉，产生了相对于相位变化的振幅变化。1.5调制对比成像调制对比光路见图6，调制对比成像也是在物镜后焦面或者后焦面的共轭面上，对倾斜入射的狭缝光，使其+1级衍射光的强度大于背景光，-1级衍射光的强度小于背景光，这样就形成浮雕效果。调制对比成像也可以配合起偏器和验偏器，通过旋转起偏器来调解浮雕效果。调制对比成像适用于各向同性和各向非同性的标本，而微分干涉仅适用于各向同性的标本。调制对比和相衬成像类似都是利用的1级或者-1级光进行调整，相对于DIC利用0级光的能量降低很多，因此调制对比成像的效果不如DIC，但是由于其对物镜的要求低、不需要复杂的棱镜、适用范围广，还是受到了广泛的欢迎。1.6荧光成像荧光成像是在落射光照明下的成像技术。光源通常为汞灯或者LED。荧光成像很多情况下标本必须用多种荧光染色剂进行染色（也有自发荧光物质，但是自发荧光能量较弱），不同的荧光染色剂会附着在细胞中需要观察的不同结构上。不同的荧光染色剂在不同波长的光的激发下会产生不同波长的荧光，这样被附着的各种细胞结构就会被观察到