CRISPR-Cas9-介导的基因编辑技术研究进展

李聪等/CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展ChineseJournalofBiotechnology(11):1531−1542DOI:10.13345/j.cjb.140589©2015ChinJBiotech,AllrightsreservedReceived:November30,2014;Accepted:February13,2015Supportedby:NationalTransgenicMajorProgram(Nos.2013ZX08008-003,2014ZX08008-003).Correspondingauthor:WenguangCao.Tel:[phone];E-mail:[e-mail]国家转基因重大专项(Nos.2013ZX08008-003,2014ZX08008-003)资助。网络出版时间：2015-04-16网络出版地址：生物工程学报CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展李聪，曹文广中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193李聪,曹文广.CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展.生物工程学报,2015,31(11):1531–1542.LiC,CaoWG.AdvancesinCRISPR/Cas9-mediatedgeneediting.ChinJBiotech,2015,31(11):1531–1542.摘要:CRISPR/Cas9(Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedprotein9)是最近发现的一种新型的基因组定点编辑技术。CRISPR即成簇的、有规律的、间隔短回文重复序列，是人们在研究大肠杆菌编码的碱性磷酸酶基因时发现的，它原本是存在于细菌和古细菌基因组中含有多个短重复序列的基因位点，能够为自身提供一种特异性免疫保护机制，抵御外来病毒、质粒等遗传元件的入侵。CRISPR系统主要依赖crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(Trans-activatingchimericRNA)结合并导向Cas(CRISPR-associatedsystem)蛋白来对外源DNA进行序列特异性降解。目前已经发现了3种类型的CRISPR/Cas系统：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅱ型系统组分较为简单，主要依赖的是Cas9核心蛋白，在RNA的介导下，Cas9蛋白能够识别靶序列进行切割造成DNA的双链断裂(Double-strandbreaks，DSB)。在此基础上，人们可以对基因组的特定位点进行基因打靶、基因定点插入、基因修复等各种遗传操作。这种新的基因组定点编辑技术比类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)和锌指核酸酶(Zinc-fingernuclease，ZFN)技术设计更加简单、更容易操作，势必会有更广泛的应用。目前，利用该技术已在多个物种的细胞和个体水平上实现了遗传操作。文中将从CRISPR/Cas9的来源、结构、作用机理方面介绍其研究进展，为开展这一领域的研究工作提供参考。关键词:基因编辑，CRISPR/Cas9系统，单链向导RNA，脱靶效应综述ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechNovember25,2015Vol.31No.11:Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)foundinbacteriaandarchaeagenomethatcontainsmultipleshortrepeatsloci,providesacquiredimmunityagainstinvadingforeignDNAviaRNA-guidedDNAcleavage.Thefirstinklingofthishotnewgeneticengineeringtoolturnedupin1987,whenaresearchteamobservedanoddlyrepetitivesequenceatoneendofabacterialgene.NowthreetypesofCRISPR/Cassystemhavebeenidentified:typesI,IIandIII.InthetypeIICRISPR/Cas9system,shortsegmentsofforeignDNAtermed‘spacers’areintegratedwithintheCRISPRgenomicloci,transcribedandprocessedintoshortCRISPRRNA(crRNA).ThesecrRNAsannealtotrans-activatingcrRNA(tracrRNA)anddirectsequence-specificcleavageinthatadouble-strandbreak(DSB)isgeneratedbyCasproteins.Basedonthesefindings,variousgeneticmethods,includinggenetargeting(Genedisruption),geneinsertion,genecorrectionetc.,arebeingdesignedtomanipulatethegenomesofdifferentspeciesatspecificloci.Comparedwithzincfingernucleases(ZFN)andtranscriptionactivator-likeeffectornucleases(TALEN),CRISPR/Cas9issimplerwithhigherspecificityandlesstoxicity.Thisreviewsummarizesrecentprogress,discussestheprospectsofCRISPR/Cas9system,withanemphasisonitsstructure,principle,applicationsandpotentialchallenges,andprovidesausefulreferenceforresearcherswhoareinterestedinthisnewtechnique.Keywords:geneediting,CRISPR/Cas9system,single-guideRNA,off-targeteffect基因组靶向修饰技术是指通过某种途径对基因组DNA特定位点进行改造的一种手段。自1987年Thompsson等[1]建立起完整的ES细胞基因敲除小鼠模型至今经过20多年的发展，该技术已经建立起许多理论与方法，其中，锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases，ZFN)以及类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)技术的应用较为广泛。但由于这两项技术DNA结合结构域的改造较为复杂，特别是ZFN，往往需要构建庞大的锌指表达文库，筛选工作量大，成为限制其发展的瓶颈[2]。CRISPR/Cas9(Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedprotein9)技术是昀近发现的一种基因组靶向修饰技术。与之前的技术相比，CRISPR/Cas9技术是通过一段RNA来识别靶位点，因而在设计和构建上更加简单。迄今为止，CRISPR/Cas9技术已成功应用于肺炎链球菌Streptococcuspneumoniae、大肠杆菌Escherichiacoli[3]、芽殖酵母Saccharomycescerevisiae[4]、秀丽线虫Caenorhabditiselegans[5]、果蝇Drosophilamelanogaster[6]、斑马鱼Daniorerio[7-8]、小鼠Musmusculus[9]、大鼠Rattusnorvegicus[10]、拟南芥[11]、玉米Zeamays[12]、水稻和小麦Triticumaestivum[13]以及包括iPS细胞在内的人体外培养细胞系[14]等多个物种内源性基因的定点修饰。本文将从CRISPR/Cas9的来源、结构以及在基因组定点修饰中的应用等方面介绍其研究进展。1CRISPR/Cas系统的研究历程1987年，Ishino等[15]在对大肠杆菌编码的李聪等/CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[e-mail]1533碱性磷酸酶基因研究时发现该基因编码区下游存在一段由长度为29bp的重复片段(Repeats)和32−33bp的非重复片段(Spacers)间隔相连的重复序列。之后的研究发现这种重复结构在细菌和古细菌中普遍存在[16]。随着人们对该结构的逐渐了解，2002年，这种结构被正式定义为Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)[17-18]。生物信息序列分析发现，在人类已知物种中，有40%的细菌和将近90%的古细菌的基因组或质粒中存在至少一个CRISPR位点[19-20]，而且其间隔序列与一些噬菌体或质粒的序列存在同源性[21]，由此预测该结构可能是原核生物在进化过程中普遍存在的一种获得性免疫系统[22-23]。随后，两个不同的研究小组分别发现该系统可以使细菌具有抵御噬菌体入侵和外源质粒转移的功能[24-25]，揭开了探究CRISPR/Cas系统分子机制的序幕，为后续研究奠定了基础。2CRISPR/Cas系统的结构与分类CRISPR作为一种特殊的DNA重复序列，主要由多段长度25−50bp的高度保守的重复片段和26−72bp长度的间隔片段间隔串联而成。对重复片段的结构分析发现，其序列存在二重对称性，即可以形成发夹结构[26-27]。对间隔片段的研究表明，它们可能是某些入侵遗传单位在细菌内的残留，为细菌提供一种抵抗外源DNA的特异性免疫[28]。对间隔片段的序列比对证实，约有2%的间隔片段在GenBank中能找到相匹配的质粒或噬菌体序列[29-30]，这可能是由于目前只有极少数噬菌体和质粒被发现并测序。在该串联结构的上游是前导序列(Leader)和一系列CRISPR相关蛋白基因(CRISPR-associatedgenes，Casgenes)，它们共同组成了CRISPR基因序列(图1)。CRISPR/Cas系统在抵御外来噬菌体入侵时，一般经历适应、表达和干扰三个阶段[31-33]。于是，Makarova等[34-35]根据适应阶段的高度保守性及表达和干扰阶段的差异性，将CRISPR系统分为3大类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR系统介导外源DNA降解过程中需要多种Cas蛋白参与反应，形成的切割复合体结构复杂[36-38]，Ⅱ型系统组分较为简单，只需要一个Cas9蛋白来切割