基因工程与基因重组

基因重组与基因工程生物工程定义生物工程是生物技术的总称，是对生命有机体在分子水平、细胞水平、组织水平、个体水平进行不同层次的创造性设计和改造，使之能定向组建具有特定性状的新物种或新品系，从而造福人类的现代应用技术学科。生物技术的四大体系•基因工程•细胞工程•酶工程•发酵工程重组DNA技术（recombinantDNAtechnique），又叫DNA克隆（DNAcloning）。在体外将各种来源的遗传物质——同源的或异源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子），继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝。这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆（molecularcloning）。一、重组DNA技术相关概念（一）DNA克隆由于DNA克隆研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作基因克隆（genecloning）。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程（geneticengineering）。1997年2月23日英国Wilmut•从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。•用合适的酶切割目的基因和载体，产生匹配的末端•在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。•将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称宿主细胞），并与之一起增殖。•筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。基因克隆的基本步骤基因克隆的基本步骤粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端酶切后的目的基因片段接(连接)连接后的重组质粒DNA分子重组质粒目的基因大肠杆菌转(转化)染色体真好玩!筛(筛选)分解抗生素的酶含抗生素的培养基还活着!玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌大量生长提取大量质粒酶切鉴定您已经掌握基因克隆的主要步骤！•分离目的基因和载体DNA。•用合适的酶切割上述两者，产生匹配的末端。•连接酶将目的基因装入载体。•转入细菌。•筛选具有抗药性克隆。（二）重组DNA中的工具酶•限制性核酸内切酶•连接酶•聚合酶•多聚核苷酸激酶•碱性磷酸酶1.限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）定义：能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。主要来源于原核生物，可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅速降解，而对细菌自身的DNA，则通过甲基化酶在该限制酶切位点甲基化修饰而保护自身的DNA不被降解。限制性内切酶和甲基化酶共同构成细菌的限制和修饰系统。限制性内切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。限制酶的命名限制酶的命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常有三个斜体字母的缩写表示。第一个大写字母取自细菌属名的第一个字母；第二、三个小写字母取自微生物种名的头两个字母；第四个字母代表该微生物同种内不同的株系；如果同一株名发现几种限制酶，则根据其被发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示。例如，从大肠杆菌（EscherichiaColi）RY13株中发现分离的第一种限制酶，称为EcoRI。限制性内切酶的分类和特点根据限制酶的组成、辅因子及切割DNA方式不同，可分为I、II、III型。重组DNA技术中常用的是II型限制性内切酶。II型酶作用特点是有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5'端为磷酸基，3'端为羟基。识别顺序一般为4~6个碱基，通常是回文结构（palindrome）。回文结构II类限制性核酸内切酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构。EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAAG…5'II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口：•在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（bluntend），如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3'3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'•在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5’端切割产生5'端突出的粘性末端，如EcoRI：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'•从3'端切割产生3'端突出的粘性末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…GACGTC…5'表15-2一些常用的限制性内切酶位点一些限制酶虽然识别序列不完全相同，但能产生相同类型的粘性末端，称为同尾酶，所产生的末端称配伍末端（compatibleend），可进行相互连接。产生平末端的酶切割DNA后，也可彼此连接。连接酶可催化DNA分子中相邻5'磷酸和3'羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。常用的有T4（噬菌体）DNA连接酶和E.ColiDNA连接酶。2.DNA连接酶3.聚合酶重组DNA技术中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA为模板在体外合成DNA或RNA。可分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。名称功能及应用大肠杆菌DNA聚合酶I以DNA为模板，催化5’→3’核酸链的延长，另有3’→5’的外切酶大片段（klenow）活性。常用于DNA3’末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、DNA测序。TaqDNA聚合酶以DNA为模板，催化5’→3’核酸链的延长，另有弱的5’→3’的外切酶活性，耐高温。常用于PCR及DNA测序。末端转移酶催化NTP中的NMP通过其磷酸基与DNA3’-OH连接而使DNA链延长，无需模板。常用于3'端标记或形成DNA共聚尾巴。逆转录酶以RNA为模板，合成cDNA链（5’→3’），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链RNA作为杂交探针。T4多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）催化ATP的γ-磷酸基转移至DNA或RNA的5'末端羟基上。常用于单链或双链DNA和RNA探针的5'端标记。4.多聚核苷酸激酶5.碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase,CIP），催化DNA或RNA的5'磷酸基水解。常用于去除线状载体DNA两端的5'磷酸基团，防止载体自身连接环化；也用于用32P标记DNA的5'末端之前除去原来的5'磷酸基。应用重组DNA技术有时是为分离、获得某一感兴趣的基因或DNA片段，或是获得感兴趣的表达产物——蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。目的基因有两种类型，即cDNA和基因组DNA。（三）目的基因（targetgene）（四）基因工程载体基因载体：或称克隆载体（cloningvector）,是在基因工程中为“携带”感兴趣的外源DNA（目的基因、外源基因）、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，具有自我复制和表达功能。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而特异设计的克隆载体又称表达载体。•能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制。•具有一个以上的单一限制性酶切位点（多克隆位点，multiplecloningsites），以便目的基因的插入。•具有合适的筛选标记（如抗药性基因，酶基因等），以便筛选阳性克隆。•载体分子量小，以便容纳较大目的基因，拷贝数高。•在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代而不易丢失。理想载体应具备的基本条件载体的分类质粒（plasmid）噬菌体（phage）病毒（virus）克隆载体（cloningvector）表达载体（expressionvector）常用的载体按来源分为载体按得到的产物分类可分为质粒（plasmid）质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞新的遗传性状。因为质粒DNA有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组DNA操作的载体。染色体质粒pBR322质粒图谱氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因多克隆位点噬菌体载体噬菌体是一种细菌病毒，可作为克隆载体。目前使用的噬菌体载体主要有λ噬菌体衍生物载体、M13噬菌体载体等。除M13噬菌体载体外，这类载体的特点是其容量比质粒载体大，即可插入较大的外源DNA片段（如20kb以上）。可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。噬菌体头部尾部尾丝•λ噬菌体λ噬菌体（lambdlabacteriophage）是一种大肠杆菌病毒，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λDNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。•λ噬菌体侵入细菌后，即可裂解生长（环状DNA在细菌中多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌），又可以溶源生长（λ噬菌体DNA整合到细胞染色体基因组DNA中，与染色体DNA一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解）。噬菌体感染细菌示意图裂解生长λ噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有关，而对裂解生长并非绝对需要，因此可以缺失或被外源DNA取代。经改造的λ噬菌体衍生载体可分两类:一类是插入型载体，即外源基因插入到载体上单一的限制酶位点，如λgt系列等。另一类是置换型，即两个限制酶位点之间的DNA片段可被外源DNA取代，如Charon，EMBL系列等。•M13噬菌体载体M13噬菌体基因组是单链环状DNA，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链DNA转变成复制型双链DNA，可提取出来做基因重组。经改造的M13噬菌体有M13mp系列和pUC系列。•M13噬菌体载体—pUC19α互补：单独存在的α及ω片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（X-gal）变为蓝色化合物。突变型lac-E.coli表达β-半乳糖苷酶的ω片段。如果插入的外源基因是在lacZ’基因内，就会影响lacZ’的表达，利用lac-E.coli为转染或感染细胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落；若无外源基因插入，则出现蓝色菌落。多克隆位点编码β-半乳糖苷酶的α片段病毒载体是一类真核载体，能把基因引入到真核细胞中，并在其中被表达。因此是研究真核细胞表达及调控的有力工具。如:腺病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒等。二、重组DNA技术基本原理•目的基因的获取•克隆载体的选择和构建•外源基因与载体的连接•重组DNA导入受体菌•重组体的筛选•克隆基因的表达（一）目的基因的获取•化学合成法•基因组DNA•cDNA•聚合酶链反应1.化学合成法已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出编码该多肽链的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。利用该法合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽、干扰素基因等2.基因组DNA利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成一定基因水平的许多片段，将这些片段与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子可能为不同的染色体DNA片段，这样全部转化细菌所携带的各种染色体片段就代表了染色体的整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合称为基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）。基因组DNA文库涵盖了基因组全部的遗传信息。建立基因组文库后，需结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，再进行扩增，将重组DNA分离、回收，以获得目的基因。3.cDNA把细胞总mRNA通过逆转录合成总cDNA，再与适当载体连接后转入受体菌，从而得到含有某种生物