基因工程第二章DNA重组技术

18:351第二章DNA重组技术18:352主要内容1.DNA的结构2.天然DNA的制备3.限制性核酸内切酶对DNA的切割.4.PCR扩增特定DNA片段5.凝胶电泳检测DNA6.DNA片段的连接重组18:353第一节DNA的结构一、DNA组成Nucleicacidispolynucleotide,NucleotidesarethebuildingblocksofNucleicAcidDNA.首尾18:354Pentosefive-carbonsugar2-Deoxyribose2｀－脱氧核糖1、核苷酸Phosphate、pentose、base(碱基)Hydroxylgroup羟基Hydrogen氢18:355Thymine胸腺嘧啶TCytosine胞嘧啶CGuanine鸟嘌呤GAdenine腺嘌呤AFourBasesinDNAPyrimidines嘧啶Purines嘌呤18:356NNNNNHHNHNHOOH2O碱基五碳糖核苷键核苷60218:357NNNNNHHNHNHOOH2OPOHOOOH2ObasePhosphatePentose核苷键Phosphateesterbond核苷酸NucleotideGlycosidicbond18:3588种核苷酸•M-单(D-二。T－三）；P-磷酸•RNA的名称为某（单、二、三）苷酸，•DNA在某（单、二、三）前加脱氧两字。•如AMP称腺苷—磷酸(或腺苷酸），•dAMP称为脱氧腺苷—磷酸（脱氧腺苷酸）。•稀有核苷酸与上类似；腺嘌呤A鸟嘌呤G胞嘧啶C尿嘧啶U胸腺嘧啶TRNAAMPGMPCMPUMP未发现DNAdAMPdGMPdCMP未发现dTMP18:3592、DNADNA中核苷酸通过3’,5’-磷酸二脂键连接18:3510headtail脱H2O脂键相连3`5`3`，5`-磷酸二酯键3’,5’-phosphodiesterbond18:3511二、DNAstructure18:35121、B型DNA双螺旋•MostDNAhavedoublehelixstructure(1).两条链反向、平行、右手螺旋有大沟和小沟5`3`5`3`18:3513(2).磷酸、戊糖在外侧，碱基在内，链间碱基形成氢键。18:3514（3）.两碱基对间距0.34nm,螺距3.4nm.18:3515经常用碱基对数来表示DNA长度(4).碱基互补配对原则：A=TC=G18:35162、DNA序列•在DNA中，两链间的碱基是互补的•知道其中一条链的序列后，另一链也可推测出来。•因此DNA序列一般只用其中一链序列由5`向3`书写5`TCTC3`3`AGAG5`5`TCTC3`18:35173、DNA变性DNA变性：DNA双链打开变异无规则的单链的过程。粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加.变性因素：加热,改变溶液pH、加有机试剂18:3518。计算公式：（G+C)%=(Tm-63.0)×2.44解链温度（Tm）•使50%DNA变性的温度.•经常在70-85C间，随G/C含量的升高而升高.18:35194、DNA复性变性因素去除后，变性DNA又恢复成双螺旋结构的过程。温度下降过快，DNA不能复性。变性复性18:35205分子杂交•具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链过程叫核酸分子杂交只要有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。18:3521DNA与DNA全部互补时部分互补时变性复性18:3522DNA与RNA全部互补时部分互补时变性复性18:35236DNA的形状线性DNA：•真核生物的染色体ＤＮＡ•部分原核生物染色体ＤＮＡ•部分病毒ＤＮＡ．18:3524环状ＤＮＡ•真核生物线粒体ＤＮＡ•叶绿体ＤＮＡ•部分原核生物染色体ＤＮＡ•质粒ＤＮＡ•部分病毒ＤＮＡ．18:3525chloroplastmitochondriaThecircularDNAcanbesupercoiled环状DNA以超螺旋形式存在环状DNA18:3526。18:3527•负超螺旋：形成超螺旋时，旋转方向与DNA双螺旋方向相反，旋转结果使DNA分子内部张力减小，称为松旋效应。在自然条件下共价封闭环状DNA呈负超螺旋结构。•正超螺旋：与负超螺旋相反，形成超螺旋时的旋转方向与DNA双螺旋方向相同，结果加大了DNA分子内部张力，有紧旋效应。18:35287DNA的复制•半保留复制（原核、真核）•Semiconservationreplication18:3529亲代DNA分子第一子代分子亲代DNA分子第一子代分子18:3530DNA复制过程•复制起始位点双链打开•引物酶合成RNA引物，•DNA聚合酶延长引物.•前导链连续延伸,•滞后链通过冈奇片段以不连续方式延伸。•在新合成的DNA链中将RNA引物剪去，以DNA替代•通过DNA连接酶将切口封闭。18:3531BubblesBubbles•复制泡:•细菌、病毒、线粒体：单复制子•真核：多个复制子，双向等速复制18:353218:35338DNA的转录•转录的过程：起始（启动子），延长，终止•转录后的加工：剪切，拼接及修饰.18:3534(1)启动子：DNA上RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列Inpromoterregions,thereisa–10regionwhichsequenceis“TATAAT”andiscalled“pribnowbox”or“TATAbox”.Thereisa–35regionwhichsequenceis“TTGACA”.Thesequencesofthetworegionsareveryconservative.18:3535promoter基因编码区5'----|-35|---|10|---A--------AUG--------------------------UGA------|T|---3'TTGACATATAATAGGAGGStartsite+1转录区terminationsequence-35region-10regionSD序列initiationcodonstopcoden18:3536(2)转录区promoter基因编码区5'----|-35|---|10|--A--------AUG--------------------------UGA-------|T|--3'TTGACATATAATAGGAGGStartsite+1转录区terminationsequence-35region-10regionSD序列initiationcodonstopcoden18:3537转录起始位点（起录点）:•转录在特定的位点开始,经常发生在A上.SD序列•在起录点下游有：AGGAGG序列，对应的mRNA序列也是AGGAGG，可与核糖体中的rRNA序列TCCTCC互补结合，起始翻译。18:3538基因编码区:•从起始密码子到终止密码子间，含有遗传信息的的DNA序列。•原核生物一个启动子和一个终止子间有多个基因编码区，每个基因编码区均有各自的起始密码子和终止密码子。•真核生物只有一个基因编码区。promoter基因编码区基因编码区5'----|-35|-----|10|--A-----AUG-------------UGA---AUG------------UGA----|T|---3'TTGACATATAATAGGAGGStartsite+1Transcriptionregionterminationsequence-35region-10regionSD序列initiationcodestopcode间隔区18:3539终止子：terminationsequence•DNA模板上的终止信号是由于DNA特殊的结构而起作用，•此处DNA多存在着反向重复顺序。•此区域容易形成发夹形结构，有助于转录的终止。18:3540•RNApolymerase中的δ亚基识别启动子区，并使RNA聚合酶结合.•DNA在起始位点解旋成单链•RNApolymerase开始转录.•δ亚基脱离，RNA开始延长.•RNA延长并从DNA中脱离•在终止子处终止.（3）转录的过程18:3541终止子18:3542转录后的RNA加工真核生物RNA转录的初级产物需经过”加帽“”加尾”“剪切”“拼接”等一系列变化才能生成具有生物活性的RNA分子。这一过程称为转录后的RNA加工(RNAprocessing)。18:35435`加帽子3`加尾巴粗品RNA剪切拼接18:35448翻译•以mRNA为模板，按照mRNA分子上的三个核苷酸决定一种氨基酸的规则（三联体密码）合成具有特定氨基酸顺序的蛋白质称为翻译。18:3545一、天然DNA的来源与用途来源：从不同生物的不同部位分离•染色体DNA(ChromosomeDNA)•病毒DNA(VirusDNA)•质粒DNA(PlasmidDNA)•线粒体DNA(MitochondriaDNA)•叶绿体DNA(ChloroplastDNA)第二节天然DNA的提取18:3546染色体DNA•特征:巨大,含有大量遗传信息(geneticinformation).•用途:分离目的基因和基因表达调控因子18:3547VirusDNA•可在宿主细胞内复制,可体外包装.•可用作转基因载体或分离目的基因.头部尾部尾丝-头部尾部尾丝VirusDNA18:3548•环状，游离与细胞质中，可自我复制。1~几百kb•主要用作基因克隆载体，也可分离目的基因。质粒DNAPlasmidDNA18:3549•真核生物(eukaryote)有,基因与呼吸作用和光合作用相关.•用途:分离目的基因或作载体.线粒体DNA和叶绿体DNA•真核生物(eukaryote)有,基因与呼吸作用和光合作用相关.•用途:分离目的基因或作载体.线粒体DNA和叶绿体DNA18:3550二、天然DNA的提取18:35511、准备生物材料1、准备生物材料•选用DNA最易提取，含量最多的组织。•大肠杆菌培养至对数生长后期。•植物选用幼嫩植株，暗培养1-2天或黄化苗。18:3552•方法:细菌(Bacteria)：•用溶菌酶(lysozyme)处理,•NaOH和SDS处理•超声波(ultrasonic)处理动植物:粉碎、捣碎、研磨2、裂解细胞-KeystepofDNAextraction18:3553•提取总DNA(ExtractionoftotalDNA)：裂解液中加酚/氯仿/异戊醇等有机溶剂，分除蛋白质，在含DNA水相加入乙醇或异丙醇使其沉淀，离心获得DNA。•提取线粒体DNA或叶绿体DNA：先分离完成细胞器，加DNase去除其他DNA，再提。•提质粒DNA：先调pH值至12.6，再调至中性，使质粒复性后从沉淀中释放出来。3、分离与抽提•提取总DNA(ExtractionoftotalDNA)：裂解液中加酚/氯仿/异戊醇等有机溶剂，分除蛋白质，在含DNA水相加入乙醇或异丙醇使其沉淀，离心获得DNA。•提取线粒体DNA或叶绿体DNA：先分离完成细胞器，加DNase去除其他DNA，再提。•提质粒DNA：先调pH值至12.6，再调至中性，使质粒复性后从沉淀中释放出来。3、分离与抽提18:3554大肠杆菌质粒DNA的提取ExtractionofplasmidDNAfromE.coli.大肠杆菌质粒DNA的提取ExtractionofplasmidDNAfromE.coli.1、细菌的培养•培养基（Culturemedium）:LB,含有抗生素（bacteriophage）•培养至对生长后期。离心收集菌体。不宜用高速长时间。18:3555solutionⅠ:葡萄糖,59mmol/L;Tris-HClpH8.025mmol/L,EDTApH8.010mmol/LsolutionⅡ:NaOH0.2mol/L;SDS1%solutionⅢ:5mol/L醋酸钾60mL;冰醋酸11.5mL;ddH2O28.5mL2、细胞裂解离心沉淀的菌体加入100uL溶液I，振荡，冰上5min，