引物设计

聚合酶链式反应(PCR)及引物设计刘彩云2011年7月22日2011年7月聚合酶链式反应（PCR）的技术原理及实验操作PCR引物设计软件的使用（PrimerPremier5.0）2011年7月聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4实验结果及讨论52011年7月实验目的了解PCR的基本原理掌握PCR的基本操作技术学习引物设计的原则及引物设计软件Primer5的使用2011年7月聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4实验结果及讨论52011年7月实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用2011年7月技术原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。2011年7月分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。正义链反义链2011年7月技术原理模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。Tm-5˚C在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA94˚C从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链72˚C变性退火延伸2011年7月出现的问题：PCR扩增未得到目的条带？扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？扩增的目的条带很弱？引物是否合适?引物设计是PCR技术中至关重要的一环2011年7月实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用2011年7月引物设计的原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。基本原则：2011年7月引物设计的原则一般原则：1.引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5℃）Tm值的计算：一般的公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)2.引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。2011年7月引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。4.引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A5.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。2011年7月引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体；发夹结构引物二聚体2011年7月实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用2011年7月缓冲液：10～50mMTris-Cl(pH8.4)维持Taq酶作用环境25～50mMKCl促进引物退火100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)对酶有一定的保护性0.5～2.5mMMgCl2Taq酶具有Mg2+依赖性2.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物0.5～2.5μMPCR的成分和作用2011年7月引物(Primer-P)：预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。0.1～1μM4.模板DNA(Template):最低102～105DNA片段，实际用量远远超过此量，用量需在实验中摸索。1～5μlPCR的成分和作用2011年7月～5U/100μl1U/25～50μl6.水：去离子水，补足整个反应体积。PCR的成分和作用2011年7月实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用2011年7月各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。PCR反应体系2011年7月操作：5份标本总体积30μl×6=180μl1.取一0.5mlEp管，加入下列试剂：10×buffer：3μl×6=18μldNTPs:1.0μl×6=6.0μl引物P1：1.0μl×6=6.0μl引物P2：1.0μl×6=6.0μlTaq酶(5U/μl)：0.2μl×6=1.2μl水：22.8μl×6=136.8μl共174μl，先用移液器/指弹混匀，后用离心机瞬时混匀（管壁上液体沉至管底）。PCR反应体系冰上操作！2011年7月管，分别加入上述液体29μl。3.分别取标本模板各1μl，加入上述5支PCR管中，混匀，离心机瞬时离心，备用。4.反应条件：PCR扩增仪PCR反应体系94℃5′94℃30″60℃30″72℃1′30个循环72℃5′2011年7月实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用2011年7月⑴变性温度和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90～95℃，30～60s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94℃30″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。PCR反应条件优化2011年7月⑵退火温度和时间：PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。退火温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，一般位于40～60℃，30～60s。退火温度越高，产物特异性越高。退火温度越低，产物特异性越低。设置退火温度梯度，摸索最佳退火温度！PCR反应条件优化2011年7月⑶延伸温度和时间：延伸温度一般位于Taq酶最适作用温度70～75℃之间，常用72℃延伸时间，可根据待扩增片段的长度和使用的Taq酶而定，一般taq酶的扩增效率是1kb/1min延伸时间过长可出现非特异扩增。PCR反应条件优化2011年7月⑷循环数：其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20～25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20～30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。PCR反应条件优化2011年7月实验原理PCR技术原理引物设计的原则PCR的成分和作用PCR反应体系PCR反应条件优化PCR的应用2011年7月、目的基因的克隆：PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR的应用2011年7月、DNA和RNA的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、基因转录水平检测RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。PCR的应用2011年7月聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4实验结果及讨论52011年7月实验仪器、试剂及耗材实验仪器及耗材PCR仪、移液器、0.2mLPCR管、各种规格的吸头。2011年7月实验仪器、试剂及耗材实验试剂10×PCRbuffer(Mg2+Plus)；dNTPmix(2.5mMeach)；TaqDNAPolymerase(2U/μL)；引物：CKB-F/CKB-R，引物溶液浓度为10μM；CKB基因模板质粒:（购自YRBIO基因库）；无菌超纯水；琼脂糖。2011年7月聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4实验结果及讨论52011年7月实验步骤准备PCR反应溶液，取0.2mLPCR管，按以下顺序加入各试剂：PCR反应体系无菌超纯水38μL10×buffer5.0μLdNTPmix2.5μL引物CKB-F1μL引物CKB-R1μL模板2μLTaq酶0.5μL合计50μL2011年7月实验步骤调整好反应程序，将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。反应程序：94℃5min；94℃30sec；60℃30sec；72℃1min10sec；30个循环，最后72℃延伸10min。每人做一管，反应完毕后，各取3μL进行琼脂糖凝胶（1.0%）电泳检测。2011年7月聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4实验结果及讨论52011年7月结果。1－2、PCR产物（3ul样品）2011年7月无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解退火温度太高2011年7月常见问题引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多退火温度偏低循环次数过多2011年7月模板不纯或降解Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次