实时荧光定量PCR技术与原理

800免费电话：800-810-2177技术的原理及应用(RealtimeQuantitativePCR)800免费电话：800-810-2177公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。800免费电话：800-810-2177讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量技术的应用800免费电话：800-810-2177反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和Ct值对未知模板进行定量分析的方法。800免费电话：800-810-2177原理定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析800免费电话：800-810-2177原理--------扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件800免费电话：800-810-2177原理-------荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即：threshold=10´SDcycle6-15手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值800免费电话：800-810-2177值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value800免费电话：800-810-2177值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性800免费电话：800-810-2177原理---------标准曲线模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量800免费电话：800-810-2177讲座提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用800免费电话：800-810-2177非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon实时荧光定量PCR原理------DNA产物的荧光标记800免费电话：800-810-2177免费电话：800-810-2177法工作原理SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreen800免费电话：800-810-2177’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation800免费电话：800-810-2177法融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光非特异性产物800免费电话：800-810-2177反应的建立反应体系的建立及优化:1.SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同800免费电话：800-810-2177法优缺点对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA使用方便-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点800免费电话：800-810-2177水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)800免费电话：800-810-2177分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光800免费电话：800-810-2177、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同800免费电话：800-810-2177法优缺点对目标序列的高特异性------阴性结果确定设计相对简单------与目标序列某一区域互补重复性比较好优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点800免费电话：800-810-2177法(分子信标)标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂发夹型杂交探针800免费电话：800-810-2177(分子信标)工作原理荧光共振能量转移（FRET）探针与DNA杂交时产生荧光------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号800免费电话：800-810-2177(分子信标)优缺点高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优点只能用于一个特定目标设计困难价格比较高缺点800免费电话：800-810-2177定量方法绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）800免费电话：800-810-2177确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理绝对定量25800免费电话：800-810-2177拷贝数用于生成标准曲线的样品如何设定？•含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒•紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度•根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释-623C(μg/μL)106.0210(μL)=660()bp拷贝数copies/载体目的片段800免费电话：800-810-2177免费电话：800-810-2177相对定量方法主要有两种:Delta-deltaCt法和双标准曲线法。由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些内标基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个内标基因。800免费电话：800-810-2177相对定量方法相对定量中的内标内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量800免费电话：800-810-2177免费电话：800-810-2177法在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线800免费电话：800-810-2177如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用ComparativeDelta-deltaCt法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。相对定量方法--Delta-deltaCt法800免费电话：800-810-2177法的一大特点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。2.当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。相对定量方法--Delta-deltaCt法800免费电话：800-810-2177相对定量方法--双标准曲线法公式：800免费电话：800-810-2177双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-deltaCT法那样对实验进行严格的优化。2.其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。相对定量方法--双标准曲线法800免费电话：800-810-2177设计实验方案：例如对样品、试验组和对照组的一个实验流程设计•引物和探针的设计和合成•提取RNA，测定RNA的浓度•反转录•定量PCR