第17章__PCR基因扩增仪

第十七章PCR基因扩增仪(PCRGeneAmplifier)◄■⊃►◈内容提要1.PCR基因扩增仪的工作原理①PCR技术的原理及发展②PCR基因扩增仪的工作原理2.PCR扩增仪的分类与结构①定性PCR扩增仪②实时荧光定量PCR扩增仪3.PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除①PCR扩增仪的性能指标②PCR扩增仪的操作规程③PCR扩增仪常见故障的排除4.PCR扩增仪的应用◄■⊃►◈内容提要3.PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除①PCR扩增仪的性能指标②PCR扩增仪的操作规程③PCR扩增仪常见故障的排除4.PCR扩增仪的应用◄■⊃►◈教学基本要求1.掌握PCR基因扩增仪的工作原理和主要性能指标。2.掌握梯度PCR仪和原位PCR仪的功能和特点。3.掌握实时荧光定量PCR扩增仪的种类；金属板式实时定量PCR仪和离心式实时定量PCR仪的特点。4.熟悉PCR技术的原理；PCR扩增仪的种类；荧光实时定量PCR（RQ-PCR）技术原理。5.了解PCR扩增仪的操作规程；PCR扩增仪常见故障的排除；PCR扩增仪的应用。◄■⊃►◈第一节PCR基因扩增仪的工作原理一、PCR技术的发展及原理1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述了PCR方法。1985年，美国PE-Cetus公司的KaryMullis等人发明PCR技术。◄■⊃►◈第一节PCR基因扩增仪的工作原理PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复“变性→退火→引物延伸”过程至25-40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。◄■⊃►◈第一节PCR基因扩增仪的工作原理PCR的基本原理◄■⊃►◈第一节PCR基因扩增仪的工作原理二、PCR基因扩增仪的工作原理从PCR反应基本原理可以看出，PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。◄■⊃►◈第一节PCR基因扩增仪的工作原理PCR仪温度控制水浴锅控温压缩机控温半导体控温离心式空气加热控温◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构PCR扩增仪的种类普通PCR扩增仪实时荧光定量PCR扩增仪梯度PCR仪原位PCR仪◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构荧光实时定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构实时荧光定量PCR仪金属板式实时定量PCR仪离心式实时定量PCR仪各孔独立控温的定量PCR仪◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构金属板式实时定量PCR仪可作为普通PCR仪使用可带梯度功能可容纳的样本量大，无需特殊耗材温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构ABI7500荧光定量PCR仪MJ公司Chromo4荧光定量PCR仪Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构离心式实时定量PCR仪温度均一性较好使用的是同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪LightCycleTM荧光定量PCR仪◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构LightCycleTM荧光定量PCR仪结构示意图◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构各孔独立控温的定量PCR仪不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合多指标快速检测。SmartCyclerⅡ的软件允许一台仪器同时操作六个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。SmartCyclerⅡ上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构SmartCyclerⅡ荧光定量PCR仪◄■⊃►◈第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除一、PCR扩增仪的性能指标（一）温度控制温度的准确性温度的均一性升降温的速度不同模式下的相同温度特性◄■⊃►◈第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除（二）荧光检测系统激发光源检测器发光二极管卤钨灯光源超低温CCD光电倍增管◄■⊃►◈第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除（三）软件简便的人性化设计最能满足其需求。新型的PCR仪很注重程序编写的简易性，易学易用，还具有实时信息显示、记忆存储多个程序、自动倒记时、自动断电保护等功能，很多还可以免费升级。◄■⊃►◈第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除（四）其他多样化样品基座设计、热盖等都使PCR仪越来越人性化。◄■⊃►◈第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除二、PCR扩增仪的操作规程普通PCR扩增仪的操作非常简便，接通电源，仪器自检，设置温度程序或调出储存的程序运行即可。定量PCR扩增仪的操作和普通PCR仪基本相同。三、PCR扩增仪常见故障的排除◄■⊃►◈第四节PCR扩增仪的应用一、感染性疾病的分子诊断和研究二、遗传性疾病的分子诊断和研究三、恶性肿瘤的分子诊断和研究四、PCR扩增仪在移植配型上的应用五、PCR扩增仪在法医学上的应用六、PCR扩增仪在分子生物学其他领域的应用◄■⊃►◈◄■⊃►◈第一节PCR基因扩增仪的工作原理以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均一性好，无边缘效应。体积大，自动化程度不高，需人为干预，更换水浴锅时控温不稳定。◄■⊃►◈第一节PCR基因扩增仪的工作原理由压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便，一台机器便可完成整个PCR流程。压缩机故障率高，边缘效应及温度overshooting现象严重。升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、金属块本身会积蓄能量，虽然温度探头探测温度到达了设定温度，但半导体、金属块上积蓄的能量仍然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设定的温度，即overshooting。◄■⊃►◈第一节PCR基因扩增仪的工作原理由半导体自动控温，金属导热，控温方便，体积小，相对稳定性好。仍有边缘效应，温度均一性尚有欠缺，各孔扩增效率可能不一致，并且仍存在温度overshooting现象。◄■⊃►◈第一节PCR基因扩增仪的工作原理由金属线圈加热，采用空气作为导热媒介，温度均一性好，各孔扩增效率高度一致满足荧光定量PCR的高要求，直接发展为离心式的定量PCR仪。◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构普通定性PCR扩增仪水浴式PCR仪：由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成。变温金属块式PCR仪：中心是由铝块或不锈钢制成的热槽，上有不同数目甚至不同规格的凹孔，用来放置样品管。变温气流式PCR仪：由机壳、热源、冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构梯度PCR仪由普通PCR仪衍生出的带梯度PCR功能的基因扩增仪。每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，根据结果，一步就可以摸索出最适反应条件。使用梯度PCR仪，多次实验可在一台仪器上完成，既节省实验时间，提高实验效率，又节约实验成本。◄■⊃►◈第二节PCR扩增仪的分类与结构原位PCR仪由普通PCR仪衍生出的带原位扩增功能的基因扩增仪。其样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可垂直放置一张载玻片，每张载玻片面均与铝槽紧密接触，温度传导极佳，控温很精确。配有支持原位PCR模块的PCR仪可以一机两用，比较经济。◄■⊃►◈第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除温度的准确性：指样品孔温度与设定温度的一致性。对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量。◄■⊃►◈第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除温度的均一性：指样品孔间的温度差异，关系到不同样品孔之间反应结果的一致性。“位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。◄■⊃►◈第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除升降温的速度：升降温速度快，可以提高工作效率，提高PCR反应特异性。样品管与基座接触的紧密性、基座的导热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度。◄■⊃►◈第三节PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除不同模式下的相同温度特性：带梯度功能的PCR仪，应考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。现有专利技术，能以同样的温度变化速率到达所有设定的梯度温度。◄■⊃►◈◄■⊃►◈◄■⊃►◈