小-大麦2H染色体重组材料创制及外源基因在小麦遗传背景

分类号：S512.1单位代码：10183研究生学号：2008861008密级：公开吉林大学博士学位论文小-大麦2H染色体重组材料创制及外源基因在小麦背景中表达研究Developmentofwheat-barleychromosome2Hrecombinationlinesandresearchonexpressionofaliengenesinwheatbackground作者姓名：邹宏达专业：植物学研究方向：植物种质资源与利用指导教师：原亚萍教授培养单位：植物科学学院2012年12月小-大麦2H染色体重组材料创制及外源基因在小麦背景中表达研究Developmentofwheat-barleychromosome2Hrecombinationlinesandresearchonexpressionofaliengenesinwheatbackground作者姓名：邹宏达专业名称：植物学指导教师：原亚萍教授学位类别：理学博士论文答辩日期：年月日授予学位日期：年月日答辩委员会主席：论文评阅人：本研究由国家自然科学基金项目(30571152)资助ThisresearchwassupportedbytheNationalBasicResearchofChina(NO.30571152).未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院：本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿，希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版，并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关权益。论文级别：□硕士■博士学科专业：植物学论文题目：小-大麦2H染色体重组材料创制及外源基因在小麦背景中表达研究作者签名：指导教师签名：年月日作者联系地址（邮编）：作者联系电话：I摘要小-大麦2H染色体重组材料创制及外源基因在小麦背景中表达研究小麦（TriticumaestivumL.，2n=6×=42）和大麦（HordeumvulgareL.，2n=2×=14)是世界上两大重要的麦类作物，通过小麦和大麦的远缘杂交，可以将大麦的优良基因及其相应性状导入小麦，如早熟、耐生物和非生物胁迫及各种品质性状。小麦成熟期穗发芽是一种世界性自然灾害，穗发芽时小麦α-淀粉酶活性提高，对胚乳中淀粉分解能力增强，不仅影响小麦产量，而且还会影响小麦的营养品质和加工品质。位于大麦2H染色体长臂上的Isa基因所编码的大麦α-淀粉酶抑制蛋白BASI（bifunctionalα-amylase/subtilisininhibitor），可以通过与小麦α-淀粉酶相结合而抑制其活性，从而降低小麦穗发芽的危害，提升小麦品质。本研究通过郑麦9023，CB037，中麦16等小麦品种与小-大麦2H染色体异代换系2H(2A)及2H(2B)的杂种幼胚组织培养，经愈伤组织诱导、继代、分化的途径最终获得522株结实的SC1代再生植株。以大麦Betzes、小麦CS、小-大麦2H染色体异附加系、一整套小-大麦2H染色体异代换系2H(2A)、2H(2B)和2H(2D)为材料共筛选出10对分别位大麦2H染色体短臂和长臂的大麦2H染色体特异SSR分子标记。通过大麦第二部分同源群特异SSR分子标记，对组培SC1代再生植株及其自交后代SC2-5代植株进行逐代筛选，以追踪和鉴定大麦2H染色体。通过以大麦Betzes基因组DNA为探针、小麦CS基因组DNA为封阻的基因组原位杂交对部分SC4及SC5植株进行进一步验证，最终获得了携带有大麦2HL染色体的杂合易位、纯合易位、单端体、双端体及单等臂体遗传材料。经大麦Isa基因特异引物进行PCR验证，以上这些材料均携带Isa基因。对小-大麦2HL染色体杂合易位系32-4-9，32-4-18及纯合易位系32-4-11花粉母细胞减数分裂I中期的染色体构型进行检测，表明杂合易位系和纯合易位系染色体配对正常，细胞学上遗传稳定。在将外源种质转移至小麦遗传背景的过程中，会引起小麦基因组结构及基因表达的广泛遗传变异。为了了解由大麦2H染色体导入而引起的小麦基因组结构的变异，采用荧光AFLP对大麦Betzes，小麦CS,小-大麦2H异附加系，小-大麦2H异代换系2H(2A)、2H(2B)、2H(2D)这一整套材料进行分析。64对引物组合在大麦中获得了3157个条带，在其它材料中获得了4736个条带。AFLP扩增类型表明，附加系中检测到了消减和激活位点，而代换系基因组结构几乎无变化。同时还检测到了多条大麦2H染色体及小麦2A、2B、2D染色体特异的AFLP片段，经回收测序后，将AFLP分子标记转换成STS分子标记并进行验证，共获得2条大麦2H染色体特异的AFLP-STS分子标记，小麦2A、2B、2D染色体特异的AFLP-STS分子标记各1条。为了了解由大麦2H染色体导入而引起的小麦基因组的表观遗传学变异，在荧光AFLP检测的基础上构建了荧光MSAP检测体系，对大麦Betzes，小麦CS,小-大麦2H异附加系，II小-大麦2H异代换系2H(2A)、2H(2B)、2H(2D)这一整套材料的基因组甲基化模式进行分析。MSAP结果表明，大麦2H染色体导入引起了小麦基因组的甲基化变异，同时大麦2H染色体本身也检测到了甲基化的升高。为了了解由大麦2H染色体导入所引起的基因表达差异，通过荧光cDNA-AFLP对大麦Betzes，小麦CS,小-大麦2H异附加系，小-大麦2H异代换系2H(2A)、2H(2B)、2H(2D)这一整套材料进行了基因表达差异分析，分离和克隆了大量差异表达基因，并初步确定了大麦2H染色体在小麦基因背景中的表达模式。通过iTRAQ技术来了解由大麦2H染色体导入所引起的蛋白表达差异，尝试对以上材料进行差异蛋白质组学分析，目前为止，共鉴定出589个蛋白。关键词：小麦，大麦，2H染色体，易位系，分子标记，基因表达IIIAbstractDevelopmentofwheat-barleychromosome2HrecombinationlinesandresearchonexpressionpatternsofaliengenesinwheatgeneticbackgroundWheat(TriticumaestivumL.,2n=6×=42)andbarley(HordeumvulgareL.,2n=2×=14)aretwoofthemostimportantcerealcropsworldwide.Thehybridizationofwheatandbarleymakesitpossibletotransferdesirablegenesandtraits,suchasearliness,tolerancetobioticandabioticstresses,andvariousnutritionalparameters,frombarleytowheat.Thewheatpre-harvestsproutingisaworldwidenaturaldisaster.Inthecourseofhighactivityofα-amylase,pre-harvestsproutingcannotonlyresultinagreatdecreaseinwheatyield,butalsodramaticallydegradethenutritionalandprocessingqualityoftheseeds.Thebifunctionalα-amylase/subtilisininhibitor(BASI)encodedbytheIsageneonbarleychromosome2HLcouldinhibitwheatα-amylaseactivitybyreducingpre-harvestsproutingandimprovingthequalityofwheat.RegeneratedplantswerederivedfromimmatureembryocultureofhybridsofcommonwheatvarietiesZhengmai9023,CB037andZhongmai16withthewheat-barley2Haliensubstituionlines2H(2A)and2H(2B)aftercallusinduction,subcultureanddifferentiation.10SSRmolecularmarkersspecifictobarleychromosome2HlocatedonshortarmandlongarmwereselectedfrombarleyBetzes,wheatCS,wheat-barley2Hadditionline,wheat-barley2Hsubstitutionline2H(A),2H(2B)and2H(2D).Thepresenceofbarley2Hchromatinwasdetectedinregeneratedplants(SC1)andtheirselfedprogenies(SC2-5)usinghomoeologousgroup2SSRmarkersfrombarley,andfurtheridentifiedinselectedSC4andSC5linesusinggenomicinsituhybridizationwithbarleygenomicDNAasprobeandCSgenomicDNAforblocking.TheIsagenefromtheidentifiedSC4andSC5lineswasalsoamplifiedusingIsaspecificprimers.Weidentifiedwheat-barley2HLchromosomeheterozygoustranslocationlines,ahomozygoustranslocationlines,monotelosomiclines,ditelosomiclines,andanisochromosomelinecarringtheIsagene.MetaphaseIpairingofline32-4-9,line32-4-18,line32-4-11indicatedthatboththewheat-barley2HLchromosomeheterozygoustranslocationlineandhomozygoustranslocationlineshouldregularlydisjoinandbestableincytology.Duringtheprocessofaliengermplasmintroducedintowheatgeneticbackgroud,extensivegeneticvariationsofgenomestructureandgeneexpressioncouldbeinducedinwheat.Tounderstandgeneticchangesassociatedwithintroductionofbarelychromosome2Hintowheatg