ABI7500-PCR-用户基本操作培训幻灯

1ABIPrism®7500型荧光定量PCR仪用户基本操作培训美国应用生物系统中国公司客户服务部2内容提要1、仪器简况2、定量PCR的数学原理3、定量PCR的化学原理4、等位基因鉴定原理5、定量PCR实验6、定量PCR的数据处理7、日常维护8、应用举例仪器简况47500功能一览•绝对定量(AbsoluteQuantification)–自动计算基线、阈值、CT值、浓度、百分比•相对定量(RelativeQuantification)•等位基因分型(AllelicDiscrimination)•阴阳性鉴定(Plus/MinuswithIPC)57500推荐使用的荧光组合报告荧光(FilterA)FAM™或SYBR®GreenI报告荧光(FilterB)VIC™或JOE™报告或淬灭荧光(FilterC)NED™或CY3™或TAMRA™参比荧光(FilterD)ROX™或TexasRed®报告荧光(FilterE)CY5™定量PCR的数学原理7PCR曲线有两种表达形式线性图谱半对数图谱8典型的PCR分4个阶段平台期线性增长期基线期指数增长期9起点定量与终点定量z起始DNA量是样本中本来的量，更有意义；终点DNA量经过PCR“加工”，不是研究所需要的数据z起点定量误差小，终点定量误差大同一个样品重复96次终点定量起点定量10什么是CT值定义：从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数CT值必须位于指数增长阶段内线性图谱半对数图谱CT值CT值CT值与起始DNA浓度的关系CT值lg起始DNA浓度CT=-klgX0+b12基线p阈值pCT值基线调整规则如果CT值18，不需调整，使用自动分析结果如果CT值18，修改终点，再分析一次起点：进口试剂取3，国产试剂取6终点：最小的CT值–4，通常为15长度：大于或等于6个循环CT值基线阈值定量PCR的化学原理14两种定量化学•染料法–SYBRGreenI•探针法–TaqMan探针–TaqManMGB探针15TaqMan探针定量原理reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.聚合probeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.链取代Q3'3'5'5'3'5'5'3.探针被切断R3'5'5'3'5'5'4.聚合完成QRR=报告基团ReporterQ=淬灭基团Quencher3'16TaqManMGB探针的好处MGB探针能够分辨1个碱基的差别FAMFAMMGB完全配对，有信号FAMFAMMGB一个碱基不配对，没有信号17TaqManMGB探针原理AGGCCTTGAGAGATATRGCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACAGGCCTTGAGAGATATR||||||||||||||||QQ(non-fluorescentquencher)NFQQMGB(minorgroovebinder)提高探针Tm值NFQMGBR报告荧光无荧光淬灭基团小沟结合物18SYBRGreenI染料法SYBRGreenI与DNA双链的小沟结合与DNA结合时发光游离时不发光19染料法的优点和缺点成本低不需要探针适合初步筛查先用SYBR筛查，再用TaqMan精确定量部分关键样品融解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体无模板特异性不能分辨主带与杂带，给出的是总信号不能做多重检测每孔只能检测一个目标基因灵敏度低适合于5000拷贝以上的基因定量20融解曲线(Dissociationcurve)只有染料法才需要做融解曲线探针法没有必要[原始数据][导数图谱]21多重荧光定量原理使用多条探针，标记多种颜色，定量多个基因基因2基因1等位基因鉴定原理23两种探针加入同一管野生型(wt)突变型(mut)24等位基因鉴定实验数据实时结果纯合子VIC杂合子纯合子FAM空白对照25等位基因鉴定实验分两步混合试剂PCR试剂+引物探针+2ng样品实时循环终点读板ABIPRISM®7500SDS分析数据定量PCR实验2796-孔板安排举例标准品未知样品阳性对照阴性对照28PCR反应程序UNG作用预防污染Taq热启动UNG灭活实时定量只要引物和探针质量符合要求循环参数就不需要修改29数据分析方法1.实验结束，软件根据默认值的基线(3-15)自动分析，给出结果和图谱2.如果CT值18，使用自动分析结果，出报告3.如果有CT值18，根据[最小的CT值-4]修改基线终点，重新分析数据30怎样获得引物探针？1.推荐到上查询现成的试剂盒，保质期5年定量试剂盒：50万个，针对人类、大鼠、小鼠、Arabidopsis和果蝇的全部基因SNP试剂盒：40万个人类SNP位点2.或者提供60-300bp的序列，AB为用户设计合成引物和探针31定量PCR反应体系试剂体积终浓度DNA510-100ng2xUniversalMasterMix251x20x引物探针试剂盒2.51xH2O17.5Total50uL50°C2min→95°C10min→(92°C15sec→60°C1min)x40循环反应总体积：96孔板25-50uL；384孔板5-15uL32金牌Taq酶的好处¾常温下没有活性，必须经过95℃10min热启动¾阻断加样后、PCR正式开始前的随机扩增及伴随产生的信号，降低本底，提高定量的灵敏度33UNG酶的好处¾有效地防止污染¾UNG酶能切断所有含dU的双链或单链DNA¾含U的DNA是PCR产物，其气溶胶造成实验室污染UUUU50℃,2minUNG34校正荧光的好处参比荧光ROX以固定的浓度混合于UniversalPCRMasterMix和SYBRGreenMix中不参与PCR反应，ROX信号强度与试剂体积、荧光激发条件等有关消除体积误差、管盖厚度误差、光学激发误差等减少孔间差异、批间差异，提高数据重现性和精度报告荧光报告荧光//参比荧光参比荧光==FAMFAM//ROXROX或者或者VICVIC//ROXROXReporterReference35ROX校正的效果没有ROX校正，就做不到定量ROX校正前ROX校正后定量PCR的数据处理37绝对定量与相对定量绝对定量相对定量600个拷贝比较两个样品增加了10倍绝对定量：绝对标准曲线法目标：确定样品中目标基因的准确拷贝数20,000copies10,000copies5,000copies2500copies1250copiesUnk1Ct=24.8Unk1浓度=4000拷贝相对定量：相对标准曲线法目的：比较基因的相对含量，不需要知道拷贝数标准品：由一个标准品梯度稀释而成Unk1浓度=0.2aUnk2浓度=0.1a相差2倍a½a¼a1/8aUnk1Ct=24.81/16aUnk2Ct=25.840相对定量：∆∆CT法依据：平均相对含量=2–平均ΔΔCT好处：不需要做标准曲线日常维护42日常维护注意事项每周维护•归档备份实验数据(.sds文件)•关闭计算机和仪器的电源开关，然后重新打开•使用不脱毛的软布擦拭仪器表面重要！切勿使用有机溶剂清洁7500PCR仪每月维护•执行背景校正•执行计算机硬盘碎片整理程序43日常维护注意事项半年维护•执行纯荧光光谱校正•执行目标区(ROI)校正以下工作根据需要进行•清除样本加热块中的荧光污染•更换卤素灯•更换保险丝•搬动仪器应用举例45I类应用：实时定量肥胖基因与糖尿病之间的关联性研究心血管疾病相关基因表达量研究溶血性胎儿贫血的早期检测转基因食品(GMO)检测癌基因表达量研究细胞凋亡的研究优生保健筛查病原体检测新药研发360046II类应用：等位基因鉴定(终点读板)•基因突变分析–单基因遗传病的诊断，如血友病、地贫等•SNP研究–疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP鉴定–SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异–药物副反应的预防，如麻醉意外•物种鉴定、菌株鉴定–病毒、细菌、真菌等用户培训用户培训1.安装完毕，工程师立即按SOP进行基本操作培训培训合格，每台仪器发2张证书2.定期定点举办系列培训班，按专题进行应用培训日程表每半年更新一次，在根据用户需要，到实验室现场进行项目培训包括理论和实验，每项3天时间，培训合格发2张证书需要更多的培训？1.日常仪器操作和报修：建议由持有基本操作培训证书的人员进行，全国服务中心免费电话：80081001922.更多基本操作培训：通过服务中心免费电话8008100192预约，安排工程师上门3.更多应用培训：与应用专家预约，参加培训班现场实验培训项目1.DNA定量2.病原微生物定量•TaqMan探针法•TaqManMGB探针法•SYBRGreenI染料法3.SNP与疾病的关联研究4.致病基因突变鉴定5.病源微生物鉴定•TaqManMGB探针法*实验培训每项3天时间，详见《技术服务手册》欢迎联系AB公司资料查询：英文原版操作手册、说明书下载基因定量和SNP引物探针试剂盒查询全国维护中心电话：8008100192欢迎联系AB公司资料查询：英文原版操作手册、说明书下载基因定量和SNP引物探针试剂盒查询全国维护中心电话：8008100192