07-基因工程克隆方案设计

基因工程克隆方案设计基因工程实验设计•1、目的基因的序列分析•2、载体的选择和分析•3、克隆策略的设计•4、引物的设计目的基因的序列分析•1、分析ORF：找到需要克隆的核酸序列•2、分析酶切位点：（1）酶切位点为0的酶；可通过引物加入，方便克隆；（2）酶切位点为1和2的酶：用于酶切克隆或基因和重组质粒的酶切分析。载体的选择和分析•1、根据目的选择合适的载体质粒：克隆、表达或其它用途。•2、MCS(多克隆位点）是否有合适酶切位点（一般是基因上没有或1个的酶切位点)•3、表达载体，要注意表达框架配对。•4、载体的酶切位点，用于重组鉴定。克隆策略的设计•1、平端克隆；•2、粘端克隆（1）TA克隆（2）单酶切不定向克隆（3）双酶切定向克隆平端克隆•机械打断，化学合成，EcoRV酶切，或其它酶切位点末端改造（klenow酶补平，S1处理）产生平端；•克隆效率较低，ligase要加大量；•载体需脱磷；•方向可正可反。TA克隆•1、普通Taq酶扩增的PCR产物3‘末端会多加一个A;•2、公司提供的T-vector的5’末端有一个粘性的T;用途:(1)PCR产物快速克隆：（2）基因测序（可正可反）；（3）利用T-vector上的MCS,为下一步克隆调整酶切位点单酶切不定向克隆•载体需要脱磷（否则，自连效率极高，外源基因无法插入）；•基因插入可正可反，需要筛选。双酶切定向克隆•类型：（1）粘-粘连接：最有效、最快捷（2）粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平•特点:(1)基因和载体都用两种酶切割；(2)连接效率高；(3)外源基因插入方向固定，不用鉴定。定向克隆的注意点：（1）两个同尾酶切出的末端一样，相当于单酶切不定向克隆；（2)载体MCS中的两个酶切位点要远一点，防止一端没切透；（可选用中间插入其它基因片断的载体酶切回收制备）。引物的设计•常规设计原则•特殊用途设计技巧引物常规设计原则1.长度：１５～３7nt,一般２０nt左右;(仅binding,不含接头)2.G+C含量４０％～６０％3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；4.引物自身不能互补（3个）5.引物之间不能互补（5个）6.引物３端不能错配,不能修饰，尽量不用A,不能超过３个连续的G或C；7.５端可变化修饰，附加酶切位点；8.两引物的Tm值应比较接近；9.正链引物：mRNA序列照抄；负链引物：先写出mRNA序列的互补序列，然后翻转重写。１０．解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T)[=20nt]Tm=81.5+0.41*(GC%)-600/L[20nt]Tm一般５５℃～８０℃［５５℃～５８℃最佳］PCR反应中结合温度（anneaningtemperature）T=Tm-5℃特殊用途引物设计技巧1.5’附加酶切位点(定向克隆):2.引入点突变3.有不确定序列4.PCR产物直接测序5’附加酶切位点(定向克隆)1、不同酶的保护碱基序列不同；NEBcatalog提供相关资料。2、有些酶的保护碱基包含其它酶切位点，注意双酶切的先后顺序:Nde1EcoR1引入点突变1.一条引物最多引入3个点突变,可延长引物长度.2.突变位点要靠近5’端.3.要注意密码子的偏好性,简并性有不确定序列－－（3～4种）5’ATGGGCICCAIAICTTCTACC3’说明：1、次黄嘌呤核苷酸I可与四种碱基配对；2、可用于PCR产物直接测序。有不确定序列－－（2种）5’ATGGGCACCATAGCTTCTA(A/C)C3’说明：1,表示该位点有两种可能的序列A或C;2.合成引物时只要一条引物的money;实际得到的是两条引物等比例的混合物：5’ATGGGCACCATAGCTTCTAAC3’5’ATGGGCACCATAGCTTCTACC3’3、设计时可靠近3‘端4、不能用于PCR产物直接测序