分子诊断在感染性疾病中的应用

分子诊断在感染性疾病中的应用袁艳军感染的慨念感染是病原体在宿主的个体内进行有害的复制、繁殖过程.病原体:细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体、寄生虫……条件致病菌微生物人体微生物人体不同的感染状态共生状态在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生感染性疾病的分子诊断策略•一般性策略（检出病原体的DNA/RNA）：–判断有无感染–是何种病原体感染–常用方法：PCR＋分子探针杂交•完整性策略–检出病原体–分型（分类）－亚型－耐药性–常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序•分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断和治疗过程中的疗效监测等•动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和病情预后评价提供客观的依据•目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等感染性疾病的分子诊断临床价值一、感染性疾病的诊断和治疗监测（一）结核分枝杆菌（二）肝炎病毒（三）人类免疫缺陷病毒（五）SARS冠状病毒（四）HPV病毒感染方式呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入机体所致疾病疾病种类多样化以肺结核为主结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点：1.结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性结核分枝杆菌(M.tuberculosis)实验室诊断现状分子生物学检测方法•近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从几周降低到几天。•结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。现代分子生物学快速诊断基因结构分子诊断共价封闭环状结构标准株结核分枝杆菌基因组全长4.4kb,包含4000个蛋白质编码基因和50个RNA编码基因基因组特点分枝杆菌核酸检测分枝杆菌菌种鉴定结核分枝杆菌耐药基因检测MDR早期诊断分枝杆菌分子诊断系统菌种鉴定筛查、鉴别诊断实时荧光PCR基因芯片快速检测平台高效：一个样本可同时检测结核分枝杆菌和NTM快速：4周（菌培）3小时灵敏：10个菌/反应（TB）；102个菌/反应（NTM）13分枝杆菌核酸检测功能：TB快速筛查；TB/NTM鉴别诊断高效：同时检测17种分枝杆菌（包括TB）快速：＞4周（菌种鉴定）6小时灵敏：103个菌/反应检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、土、龟-脓肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。14分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法）通量：两个一线抗结核药（MDR）速度：8周（药敏）6小时灵敏度：103个菌/反应基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对耐多药结核病做出快速诊断。15结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒病毒性疾病的分子检测乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）•全世界有3.5亿慢性携带者，75%在亚太地区•每年有一百万人死于HBV感染，是全球范围内第9位死因•中国：50%~70%的人受过感染，8%~10%是HBV携带者世界其它地区亚太地区75%75%的长期慢性携带者来自亚太地区HBV的形态特征DNA病毒双链（非环状）DNA不等长正链（2/3）负链最常见的血清型为adw、adr和ayw亚型的地区分布不同，我国以adr为主，adw次之，而ayw见于新疆、西藏和内蒙古等地HBV基因组结构pre-S1pre-S1蛋白pre-S2pre-S2蛋白SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAg编码HBsAgpre-S2pre-S1S区C区P区X区基因重叠急性感染时期HBV的标志物HBV检测窗口期血清学（HBsAg）：56天PCR：33天缩短23天（平均6-15天）HBV分子诊断方法扩增位置引物序列扩增片段大小(bp)P、X基因特异片段5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’Ｃ基因特异片段5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’Ｃ基因特异片段5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’HBV-DNA检测（PCR）PCR引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。PCR引物常根据其S、C、P和X基因中的高度保守序列来设计。部分常用的引物序列•1．样本处理（样本处理区）•2．核酸扩增–2.1试剂配置（PCR前准备区）–2.2加样（样本处理区）–2.3PCR扩增（检测区）HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）试剂制备标本处理扩增检测xxxHBVDNAFQ-PCR（real-timePCR）•结果判断：•FQ-PCR进行HBVDNA的定量检测，检测范围为2.5×102~2.5×109copies/ml•检测样本中5×102copies/ml≤HBVDNA≤5×107copies/ml，测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数•检测样本中HBVDNA5×107copies/ml，既可直接报告为5×107copies/ml，也可用正常人血清按10倍剃度做相应稀释，使其拷贝数落在1×105-5×107copies/ml范围内，再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正•检测样本HBVDNA5×10²copies/ml时，拷贝数仅供参考，报告为小于最低检出限•Ct值无数值时,报告为0.0copies/ml支链DNA（bDNA）技术一种核酸探针杂交标志信号放大技术。优点：稳定性和重复性较好，结果准确，操作简单，将待测病毒裂解释放核酸后变性为单链，即可进行检测。缺点：敏感性较低、检测范围窄而不适用于低水平病毒的检测。还可以用于乙肝病毒基因检查的方法主要有：荧光PCR法、竞争PCR法、PCR酶联免疫吸附法、荧光标记物法和PCR酶联化学发光等方法。变异株与耐药突变检测•HBV可能发生自然变异•HBV在人体活疫苗接种和抗病毒治疗等压力下发生变异•HBV基因组的变异常引起病毒生物学特性的改变，从而导致HBV感染发病机制的变化、血清学检测指标的改变以及免疫逃逸，给乙型肝炎的诊断和治疗带来困难一、感染性疾病的诊断和治疗监测HBV耐药突变类型及其核苷酸、氨基酸变化46.91℃54.64℃50.74℃丙型肝炎病毒（HCV）•急性丙肝的临床诊断–1.流行病学史：有输血史、应用血液制品史或明确的HCV暴露史。–2.临床表现：全身乏力、食欲减退、恶心和肝区疼痛等，其他可有低热，轻度肝肿大，脾肿大，黄疸。部分患者无明显症状。–3.实验室检查：ALT多呈轻度和中度升高，抗-HCV和HCVRNA阳性。•约90%的输血后非甲非乙型肝炎和7080%的无输血史的散发型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致HCV•血中HCV含量仅为HBV的千分之一•HCV的细胞培养尚未成功，病毒的分离极为困难•HCV的变异性很高，使其诊断十分困难•HCV的免疫学标志仅有抗HCV一项，且由感染至抗体产生大约需要70天，部分病人感染后始终都不形成抗体HCV分子诊断技术尤为重要HCV基因组（单链RNA）•呈球形颗粒•直径约50nm•有一脂质包膜•核心：单股正链RNA，全长9.4kb•仅一个开放读框（ORF），编码一条含有30083037个氨基酸的病毒前体多肽HCV基因分型的多样性•由于HCV的RNA聚合酶的忠实性不高，所以引起HCV的基因型呈多样性•HCV分为6个主要基因型（Simmonds），HCV亚型已超过50个.•HCVRNA基因分型有助于判定治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案.HCV分子诊断•HCV-RNA定性试验•逆转录PCR•有许多因素影响着PCR方法，如标本处理及储存形式，引物设计、扩增倍数、反应条件、DNA产物的污染、扩增后产物检测系统等•严格的质控、操作人员的熟练程度尤为重要–HCVRNA定性检测的特异度在98%以上，只要一次病毒定性检测为阳性即可确证HCV感染–一次检测阴性不能完全排除HCV感染，应重复检查HCV-RNA定量试验•估价血清中HCV-RNA水平•反映感染机体的病毒复制率及清除率•在未治疗的慢性丙肝机体内病毒负荷相对稳定•目前有二种方法可定量HCV-RNA水平-靶扩增技术如定量PCR方法-信号扩增技术如支链DNA法HCVRNA定量（real-timeRT-PCR）•质控标准–阴性对照的检测结果为阴性–强阳性对照的Ct值应小于等于30.0–临界阳性对照的Ct值应大于强阳性对照的Ct值–否则此次实验视为无效•结果判断–Ct值无数值的样本为阴性样本–Ct值≤36.0的样本为阳性–Ct值大于36.0的样本建议重做，重做结果无数值者为阴性，否则为阳性HCVRNA定量结果表示方法•HCVRNA定量检测法有两种表示方法：–拷贝/ml（罗氏公司CobasV2.0）–IU/ml（美国国立遗传学研究所的SuperQuant）–两者之间可以进行换算，IU/ml与拷贝数/ml换算公式是：IU/ml=0.854拷贝数/ml+0.538特别说明•应注意HCVRNA检测中的假阳性和假阴性•在HCV急性感染期，在血浆或血清中的病毒基因组水平可达到105～107拷贝/ml•在慢性感染者中，HCVRNA水平变化范围在5×104～5×106拷贝/ml之间，同一患者血液中HCVRNA的水平相对稳定•HCV病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可以作为抗病毒治疗疗效评估的观察指标（“评估”和“预测”）HCV基因型测定•检测基因型方法一般分为二类：⑴检测HCV基因的点突变的筛选试验⑵评估HCV基因更大片段的验证性试验•HCV基因型的筛选试验有：(1)对HCV高度保守的5’-NC区域行限制性片段长度多型性分析（RFLP）(2)对HCV-5’NC区域行逆转录斑点杂交分析，又名LIPA方法(3)用型特异的引物对HCV核心基因巢式PCR。(4)病毒蛋白抗原性分型•评估HCV基因更大片段的验证性试验-----序列分析人类免疫缺陷病毒（HIV）全国累计报告HIV感染者地理分布1-100101-500501-10001001-50005001-1000010000HIV感染者数截至2005年12月底HIV在宿主细胞中的复制Step1:BindingStep2:ReverseTranscriptionStep3:IntegrationStep4:ReplicationStep5:TranslationStep6:ViralAssembly靶细胞：CD4+T细胞HIV基因组•基因组为RNA双分子，与其它逆转录病毒基本相同•其正链RNA分子大小为HIV-19.3kb有3组共8个基因HIV-29.7kb有3组共9个基因•5’端有帽子结构，3’端有poly(A)结构HIV基因组•第一组：逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序gag（groupofantigen)基因：编码核心蛋白pol（polymerase）基因：编码逆转录酶，DNA聚合酶env（envelop）基因：编码包膜蛋白–LTRs：不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性•第二组：参与基因表达的调节基因tat（trans-actingtranscriptionalgene）rev（regulatorofexpressionofviralprotein）nef（negativeregulatorfactor）•第三组：负调控病毒的感染性，成熟或释放的基因vif（viralinfectivityfactor）vpu（viralproteinU）vpr（viralproteinR）HIV基因组遗传变异率高•高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段•HIV疫苗研发难度大HIV-1感染后病毒标志物的变化窗口期：检测抗体2-12周检测p2