第4章-核酸分子的酶切、连接和修饰

第四章核酸分子的酶切、连接和修饰第一节DNA分子的酶切一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）1、限制性核酸内切酶的发现限制修饰系统（Restrictionmodificationsystem）是存在于细菌等一些原核生物体内，可保护自身免于外来DNA（如噬菌体）侵入的一个系统，包括限制和修饰两个方面的作用。限制(Restriction)是指细菌的限制性核酸酶对入侵DNA的降解作用，这就限制了外源DNA侵入所造成的危害。修饰(Modification)是指细菌的修饰酶对于自身DNA碱基分子的甲基化等化学修饰作用，经修饰酶修饰后的DNA分子可免遭细菌限制酶的降解作用。2、限制性内切酶的类型和命名Ⅰ型和Ⅲ型酶在基因工程研究中的应用价值不大，通常所说的限制性内切酶都是Ⅱ型酶。表4-1三种限制性内切酶的特点比较特征I型II型III型限制修饰活性单一多功能酶限制和修饰活性分开双功能酶蛋白质结构三种不同亚基单一成分两种不同亚基限制作用的辅因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸切割位点距特异性位点1000bp外的位置随机切割特异性位点或附近距特异性位点3’-端24—26bp位置甲基化作用位点特异性位点特异性位点特异性位点识别未甲基化位点进行核酸内切酶切割能能能序列特异性切割否是是在基因工程中应用广泛否是否使用限制性内切酶寄主菌的种属名称，来命名限制性内切酶限制酶来源剪切方式EcoRIEscherichiacoliRY13G↓AATTCHindⅢHaemophilusinfluenzaeRdA↓AGCTT3、Ⅱ型限制性内切酶的作用方式（1）识别并切割特异核苷酸序列（2）识别序列都是回文序列（3）切割后形成各种粘性末端或平整末端GGATCCCCTAGG5'3'5'3'BamHⅠ的识别序列AAGCTTTTCGAA5'3'5'3'HindⅢ的识别序列图4-1几种Ⅱ型限制性内切酶的识别和切割序列图4-2杂交位点的形成及其切割二、限制性内切酶切割DNA的方法（一）单酶切割DNA样品图4-3单酶切割的DNA通过互补末端载体DNA的连接GGATCCCCTAGGBamHⅠ的识别序列及切割部位GGATCCCCTAGGBamHⅠ含目的基因的DNA片段BamHⅠGCCTAG5'3'5'3'5'3'3'5'3'5'3'5'GGATCCCCTAGGGATCCG目的基因片段混合、退火GCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAG质粒载体含目的基因的重组质粒图8-4同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接GCCTAGGATCCGDNA连接酶图4-4质粒的图谱及其酶切检测结果（二）双酶或多酶切割DNA样品图4-5双酶切割的DNA通过互补末端载体DNA的连接GGATCCCCTAGGBamHⅠBamHⅠBamHⅠGCCTAG5'3'5'3'5'3'3'5'3'5'5'GAATTCCTTAAGAATTCG目的基因片段混合、退火GCTTAAGATCCGAATTCGGCCTAG重组质粒DNA连接酶HindⅢHindⅢ3'GATCCGGCTTAAAATTCGGCCTAGGATCCGGCTTAAHindⅢAATYCGGCCTAG5'3'载体（三）DNA样品的部分酶切图4-6DNA样品的部分消化（A）基因组DNA电泳；（B）基因组DNA部分酶切结果三、影响限制性内切酶活性的因素1.DNA样品纯度2.DNA甲基化程度3.缓冲液条件4.酶切反应温度5.DNA分子结构四、DＮＡ酶切的应用图4-7重组质粒构建实例第二节DNA分子的连接一、连接酶连接酶(Ligase）是一类能将两个核酸片段连接起来的酶。目前已研究发现多种不同来源或作用于不同底物的连接酶类，这里主要介绍：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶、热稳定DNA连接酶和T4RNA连接酶。二、粘性末端DNA片段的连接（一）相同粘性末端的连接（二）不同粘性末端的连接三、平末端DNA片段的连接（一）平末端DNA片段的直接连接（二）同聚物加尾法（三）接头连接四、影响连接反应的因素图4-8同聚物加尾连接示意图图8-6同聚物加尾连接示意图GGGGGGGGGGGG5＇3＇CCCCCCCCCCCC3＇5＇5＇3＇3＇5＇5＇5＇5＇5＇CCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGA片段B片段图4-9利用接头分子的连接示意图图8-7连接物分子连接平末端的DNA片段示意图5＇3＇3＇5＇GGATCCCCTAGG3'5'5＇3＇BamHⅠ接头多核苷酸激酶连接酶5＇3＇GGATCCCCTAGG3'5'GGATCCCCTAGGBamHⅠ切割GCCTAG3'5'GATCCG3'5'BamHⅠ切割的质粒载体3'5'3'5'GCCTAGGATCCGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAG重组质粒目的基因第三节DNA分子的修饰一、DNA修饰酶1、末端转移酶2、T4多聚核苷酸激酶3、碱性磷酸酶二、T4多聚核苷酸激酶对DNA的修饰作用1、5’-OH末端磷酸化2、核酸分子5`-端的标记三、碱性磷酸酶对DNA的修饰作用思考题1、什么是DNA限制性内切酶；基因工程中常用的是哪种类型，如何命名？2、Ⅱ型限制性内切酶有哪三个主要的作用特性？3、请以表格比较并说明常用DNA聚合酶及其性质。4、利用逆转录酶和mRNA模板合成cDNA的主要步骤是什么？5、请总结出DNA单酶切分析的一般实验方法。6、为什么通过碱性磷酸酶处理可以防止质粒载体DNA自连的作用？