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观察DNA和RNA在细胞中的分布——Brachet反应光镜下常用的核酸染色方法Brachet反应的染色原理甲基绿(Methylgreen)和吡罗红(Pyronin,又译派若宁、派洛宁,又称焦宁)染色液(Unna试剂)的配制方法步骤及结果的比较可参考书目必修一实验三光镜下常用的核酸显色方法显示DNA——多用Feulgen反应:1N盐酸60℃水解8~10分钟(使DNA分子暴露出醛基),水洗去盐酸后,用Schiff试剂染色该反应优点:1。专一性强2。可用于定性和定量分析显示RNA——多用Brachet反应该反应优点:可同时显示DNA和RNA缺点:专一性不强(1。甲基绿、派若宁均为碱性染料,甲基绿单独使用时能使DNA和RNA均染成蓝绿色,派洛宁单独使用时能使DNA和RNA均染成红色。2。甲基绿同时可染其他物质如粘液)染色原理将甲基绿和派若宁配成混合染液(Unna试剂)时,甲基绿多和DNA选择性结合显示蓝绿色,派洛宁多和RNA选择性结合显示红色。其原因可能是当配成混合染液时,两种染料同时存在而出现竞争作用:甲基绿与DNA亲和力大,易和聚合程度高的DNA结合,而派洛宁与聚合程度较低的RNA结合。但空间构型不完整的DNA也能与派洛宁结合显示红色。故用该法所得的红色反应来显示RNA的存在并不具有专一性。需做对照试验:利用专一性的RNA酶使嗜派洛宁染色性消减,这种反应具专一性,借助该反应才能说明被染上红色的确是RNA,故做对照实验是必要的。DNA染料一般认为甲基绿与DNA亲和力高、派若宁与RNA亲和力高的原因有两个:1、DNA和RNA分子的聚合程度不同,DNA比RNA聚合程度高。2、甲基绿分子的两个N基团正电荷的距离正好与DNA分子的负电基团间的距离相一致所以容易结合,而派若宁只有一个N基团正电荷,竞争不过DNA与甲基绿的结合见上图)故一般认为甲基绿对DNA的结合能力主要与DNA分子的双螺旋空间构型的完整性有关甲基绿甲基绿生产厂家不同,甚至批号不同染色效果会有较大差别。商品甲基绿常混有甲基紫,会影响染色效果。甲基绿溶于水,不溶于氯仿(三氯甲烷);甲基紫溶于氯仿。利用该特性可用氯仿洗脱甲基紫:将甲基绿水溶液放入分液漏斗,加入氯仿,用力振摇,然后静置,待溶液分层后弃氯仿。如此反复数次,直到氯仿不呈紫色为止。派若宁有PyroninY、B等,Y是四甲基化合物,B是四乙基化合物。有学者认为Y适用于该反应,B会使胞浆产生非特异性染色。染色液(Unna试剂)的配制甲液:5%Pyronin水溶液(可加热助溶)6ml2%甲基绿水溶液6ml蒸馏水16ml乙液:1M醋酸盐缓冲液(pH=4.8)16ml(配方:A液:冰醋酸6ml加蒸馏水至100mlB液:醋酸钠13.6克加蒸馏水至100ml取A液40ml+B液60ml混匀即为pH=4.8的缓冲液一周内有效,用前现配)甲乙两液分别置4℃冰箱备用,用时混匀。(上述配法参考汪德耀主编《细胞生物学实验指导》1981高教版其它配法可参考芮菊生等编著《组织切片技术》1980高教版)配制注意事项:①吡罗红(Pyronin)可加热助溶。②甲基绿(Methylgreen)批号不同,染色效果差别很大。商品甲基绿常混有甲基紫,影响染色效果,应先把药品放在分液漏斗中,加入足量的氯仿,用力振荡,然后静置,直到洗脱甲基紫为止,最后干燥备用。方法步骤及结果的比较一.核心步骤:Unna试剂染色5~30′染色前不做盐酸处理也可观察到正确的染色结果.二.辅助性步骤:(一).盐酸处理此步骤需处理得当才有高中教材中所述作用效果。若浓度过高、处理温度过高、时间过长,结果核不是呈蓝绿色,而是与细胞质一样呈红色。关于盐酸浓度:质量分数8%盐酸处理所得结果体积分数8%盐酸处理所得结果(二)有些资料介绍染色后用丙酮短时间(多为30〞)处理有分色的效果方法与步骤实例(洋葱鳞茎内表皮)实验片:撕取小块洋葱鳞茎内表皮,置载玻片上。↓滴1~2滴95%酒精,处理10分钟↓滴2滴Unna试剂,染色15分钟↓吸去多余染液,滴加蒸溜水漂洗2次,吸去多余水分。↓盖上盖玻片,镜检。实验片:在洁净载玻片上滴一滴生理盐水,漱口,用消毒牙签刮取口腔上皮细胞,将附有材料的一端放在载片液滴中涂抹几下→点燃酒精灯,烘干。↓滴1~2滴95%酒精处理10分钟。↓滴1滴Unna试剂,染色10分钟↓吸去多余染液,用清水洗净。↓盖上盖玻片,镜检。方法与步骤实例(人口腔上皮细胞)实验方法改进人口腔上皮细胞染色及观察将课本上“步骤二、水解”一步删除,以避免HCL带来的影响,这样细胞核能被染成绿色。推测HCL除了影响吡罗红甲基绿染色剂作用的pH值以外,还有可能作用于DNA使之变性而不能与甲基绿染料分子结合导致实验失败。洋葱磷叶表皮细胞染色及观察在洁净的载玻片上滴加8%的HCl一滴,将小块洋葱鳞叶表皮置于液滴中浸泡5min,反复用1%NaHCO3溶液清洗材料3次,用吸水纸将载玻片上液滴吸干,滴加一滴吡罗红甲基绿试剂染色5min后,盖上盖玻片,在显微镜下观察。课本录像中的实验效果吡罗红甲基绿染色剂染色的口腔上皮细胞(经质量分数为8%的盐酸水解)经质量分数为8%的盐酸水解、吡罗红甲基绿染色剂染色的口腔上皮细胞经质量分数为8%的盐酸水解、吡罗红甲基绿染色剂染色的洋葱鳞茎内表皮细胞按课本操作后实际实验效果改良后的实验效果吡罗红甲基绿染色剂染色的洋葱鳞茎内表皮皮细胞(未经8%盐酸水解)吡罗红甲基绿染色剂染色的口腔上皮细胞(未经8%盐酸水解)可参考书目汪德耀主编《细胞生物学实验指导》1981高等教育出版社芮菊生等编著《组织切片技术》1980高等教育出版社徐根兴著《定量细胞学和细胞化学技术》1993吉林科学技术出版社赵刚、刘建中主编《医学细胞生物学实验与习题》1999科学出版社王金发、何炎明主编《细胞生物学实验教程》2004科学出版社(用0.03M(约为体积分数0.3%)盐酸处理细胞5′已可使DNA酸变性为单链而与Pyronin结合成红色)
本文标题:03观察DNA和RNA在细胞中的分布
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