热力学因素对绵羊重组朊蛋白体外构象转化的作用g6%(j6j67,(+e

中国农业大学学报!!#!$%%#$!$&!F’()*+,-(./01+,23*14)-5)*,-6+178*915:热力学因素对绵羊重组朊蛋白体外构象转化的作用王伊琴$!!!秦贞奎;!包勇敢!!乔俊文$!赵德明$$K中国农业大学动物医学院%国家动物传染性海绵状脑病实验室!北京$$#;(!K内蒙古二连浩特出入境检验检疫局!内蒙古二连浩特$$$(;K中国检验检疫科学研究院!北京$$!;#摘!要!构建了绵羊朊蛋白的原核表达载体#获得了高纯度的融合表达蛋白$并在热力学因素的作用下#研究了重组绵羊朊蛋白的构象转化$以基因型为2=D(2=D蒙古绵羊的血液AB2为模板#利用AB2重组技术#将绵羊朊蛋白正常成熟蛋白基因Y7@*@插入表达载体SI;,#在大肠杆菌C?!-!AI;中高效表达#获得的表达产物以包涵体形式存在#并对其进行纯化和复性$超滤浓缩后浓度约为\HJ3(J?的Y7@*@#F&!;%#进行热力学处理#利用远紫外线圆二色谱!/A分析热力学处理前%后蛋白的二级结构的变化#同时#对热力学处理前%后的蛋白进行了蛋白酶Z抗性的检测#并对其高级结构进行了预测$结果表明’获得的表达产物经PAP&@2OI分析可见分子量为$E[A的蛋白条带#c8958*+&X-(551+3的鉴定证实了所获得的蛋白是特异性的朊蛋白$经’,94(a;!软件分析#测得天然构象的Y7@*@#F&!;%的二级结构含量为’&螺旋为!G\G‘%(折叠为‘%转角和无规卷曲为F$\$‘#无蛋白酶Z的抗性$经过热力学处理之后#Y7@*@#F&!;%的二级结构含量为’&螺旋为$#\;‘#(折叠为;E\#‘#转角和无规卷曲为%;\G‘#有一定的蛋白酶Z抗性$绵羊重组朊蛋白的体外构象转化的分析为朊蛋白的体外构象转化机制和致病机理的研究提供科学依据$关键词!绵羊重组朊蛋白&原核表达&构象转化&圆二色谱&热力学因素中图分类号!PGH!KEH#KF(DFGE!!!文章编号!$F&%;;;!##%&!$&F!!!文献标志码!2收稿日期$!G&$!&;基金项目$国家自然科学基金资助项目;GF$GH%#(国家科技支撑计划资助项目!EC2AE2$;#第一作者$王伊琴!博士研究生!高级兽医师!主要从事出入境动物检验检疫工作!I&J,1-$X:3a:^!$E;K4(J通讯作者$赵德明!博士!教授!博士生导师!主要从事动物传染性海绵状脑病的研究!I&J,1-$L0,(NJ!4,)K8N)K4+秦贞奎!研究员!博士生导师!主要从事重大动物疫病诊断和防控技术的研究!I&J,1-$^L[4,1^!$E;K4(JG..6%’(.’J6’J67,(+E)&,$%.&%’(7()%().(7,&’$()&#%()867*$()(.’J6(8$)67$()7(’6$)$%&$’()=!?X$0Y$)L!M!V;BJ6)0T:$R!P!OX()505&)M!V;!OW:)0F6)L!BN!OH60,$)5L9EI,0/),#’)/*,#=(,)3*/33/D#$K)%/&(*4)1$2,#,02/$3B,D(,0(+%!##$%$&V$0$(/),(+S$-/1/)$!!2/),’%(/15#05(,#6)/7$(3/0+!.$/8/)%9::9;!!2/),(LE4(#/,)204)0(+?4Q/0T)3$10/),)-\5,(,)0/)$!T))$(S)%#/,:999::!!2/),(E!2/)$3$’1,-$*+&T)3$10/),)-\5,(,)0/)$!.$/8/)%9::9L!!2/),#!9*’7&%’!=2/3305-+D0,/)$-&53/)(0$/)G/022/%25(/0+&7/)$(/)(0$/)!,)-1)30(510$-02$($1*D/),)0(U,(+0/1$Q($33/)7$10(&(7/)$(/)(0$/)%$)$ET0/)7$30/%,0$-02$1)&(*,0/),#1)7$(3/)&7/)$(/)(0$/)D+02$$&&$10&02$02$(*,#-$),05(,0/)/)7/0(E=2$7/)$(/)(0$/)%$)$C()#G,3$Q($33$-/)4E1#/ED+02$HI’($1*D/),0/)E=2$R7C(C!115(($-/)02$3$)3/0/7$1$##3.BL9#D+02$-$),05($-/)1#53/)D-+E’&0$(5(/&/1,0/),)-($&#-,0/)&02$($1*D/),)0R7C(C!!1)&(*,0/),#12,)%$3&7/)$(/)(0$/)G,30(/%%$($-D+02$(*,#-$),05(,0/)E=2$($35#0332G$-02,0*#$15#,(G$/%20&02$0,(%$0(0$/)G,3,(Q/*,0$#+9NXOXEH,)-/033$33$-02$,)0/%$)0/1,10/7/0+&R7C(C;X?LPE!/(15#,(-/12(/3*3$10(,32G$-02,002$1)0$)0&30(5105($G,3&2$#/QL]E][#!(32$$0:#!05*,)-&($$-*15(#X9Z9[#!-/%$30$-D+C(0$/),3$^E’&0$(02$(*,#中国农业大学学报!#年第$%卷!-$),05(,0/)!1)&(*,0/),#12,)%$3&02$7/)$(/)(0$/)G,332G)/)!H3$10(,E=2$1)0$)0&30(5105($G,3&2$#/Q9;Z[#!(32$$0OZ;[#!05*,)-&($$-*15(#PZ][#EC(0$/),3$^-/%$30/),33,+32G$-02$(0$/),3$?($3/30,)1$E=2$&/)-/)%/)-/1,0$-02$1)3$J5$)0*#$15#,(*$12,)/3*3&C(C1)7$(3/)0(/%%$($-D+02$(*,#-$),05(,0/)!,)-02$/)&(*,0/)%,/)$-&(*02$($3$)0305-+*,+(7/-$)$G/)3/%20/)002$*$12,)/3*&(/)-/3$,3$3ED6EF(7+*!($1*D/),)07/)$(/)(0$/)((U,(+0/1$Q($33/)(1)&(*,0/),#12,)%$(1/(15#,(-/12(/3*3$10(,(02$(*,#-$),05(,0/)!!朊蛋白病又称为传染性海绵状脑病PI#!是由致病性朊蛋白引起的一种致死性神经退行性疾病+可感染多种属动物!其中疯牛病-羊痒病和人的克雅氏病是最常见的海绵状脑病)$*+@*)91+8*&唯蛋白’理论表明!海绵状脑病的致病因子是一种编码宿主蛋白的@*@/转变为异常的具有致病性的@*@P4!二者都具有相同的氨基酸序列!只是空间结构发生变化!由正常的以&螺旋为主的结构@*@/#转变为以(折叠为主的结构@*@P4#!在脑部沉积而产生致病性)!&;*+利用()*18*转换红外光谱Q=#和圆二色谱/A#对两者结构进行比较!发现它们在二级结构上有很大区别$@*@/含%‘的&螺旋!而含有很少或几乎不含(折叠!相反@*@P4则含有%;‘的(折叠及;‘的&螺旋+@*@/对蛋白酶Z敏感!而@*@P4具有蛋白酶Z抗性!因此!高含量的(折叠-不溶性-蛋白酶Z抗性和@*@的纤维化形式是被认为是致病性朊蛋白的基本特性)%&H*+朊蛋白基因在健康动物和人类的大脑及其他组织都有表达+@*@/细胞型朊蛋白#和@*@P4羊瘙痒症相关朊蛋白#!它们的大小和B端序列完全相同!并有类似的糖基化模式!但具有不同的生化特性$$#在非变性去污剂中@*@P4不溶(!#@*@P4具有相对的抗蛋白酶水解特性(;#@*@/和@*@P4都依赖O@Q附着在细胞膜表面!经磷酸肌醇磷脂酶/@Q@?/#酶解后@*@/从膜上释放出来而@*@P4不释放!用*15(+U&$$%进行相分配后!@*@/处于水相而@*@P4处于*15(+U&$$%相中(%#特异的抗体只与@*@P4有血清反应!而与@*@/无反应!证明两者含有不同的构象表位)E*+绵羊朊蛋白是单拷贝的朊蛋白基因编码!整个开放阅读框Y=#在一个外显子内)F*+绵羊的朊蛋白的全序列包含FF$XS核苷酸!编码!HE个氨基酸的前体蛋白!包括B&端的!!个氨基酸的信号肽和/&端的!;个氨基酸的O@Q信号肽+本试验旨在研究热力学因素对朊蛋白体外构象转化的影响!为朊蛋白的体外构象转化和致病机理的研究提供依据+’!试验材料与方法’K’!材料$#质粒-宿主菌+SOIW&8,9:载体购自@*(J83,(ARH&和?!$AI;#购自*,+938+公司(SI;,k#由本室保存+!#主要试剂++/%酶-J4;酶和%AB2BIC#连接酶(IKgKBK2K=#O8-IV5*,51(+Z15-IKgKBK2K=#@-,9J1NW1+1Z15YJ83,公司#-基因组AB2提取试剂盒C1(A87&840公司#-@*@单克隆抗体2RE英国PI=898,*40/8+58*#(A?&!-Q@O-NB@-IV&,^@-)9酶-氨苄青霉素和U&3,-大连宝生物公司#+;#动物血样+无菌采集蒙古绵羊的抗凝血液!基因型为2=D%2=D!即在E#;4的$;E-$H%-$F$位点的氨基酸分别是2-=-D2=D%2=D#!该基因型的绵羊对羊痒病中度易感+’K(!方法’K(K’!@/=引物的设计根据O8+C,+[中绵羊朊蛋白的基因序列2AEFF!;$#!设计$对扩增引物+上游引物@$$HT&2OOO2//OO2O//2/2O/2OOO2&;T!下游引物@!$HT&/2O/O2/2/O//////OO2&;T+在上下游引物HT端分别引入+/%%J4;酶切位点和;个保护碱基!以便于酶切和克隆!引物由上海生工合成+’K(K(!Y7@*@#F&!;%的克隆%克隆载体和表达载体的构建基因组总AB2的提取按试剂盒方法操作+@/=反应在!H$?体系中进行!其中含有$基因组AB2!+3!引物\H$J(-%?(NB@!$J(-%?(,^S-)9AB2@(-:J8*,98H6%$?#\H$?(\$J(-%?$l2JJ(+1)JC)..8*(去离子水$F!!!第%期王伊琴等$热力学因素对绵羊重组朊蛋白体外构象转化的作用$?!进行@/=扩增!循环条件如下$#%]预变性HJ1+-#%]变性;9-HG]退火%9-F!]延伸%9-共循环;E次-最后于F!]延伸GJ1++扩增产物纯化按试剂盒做!纯化后@/=扩增产物与SOIW&8,9:7845(*进行连接!%]水浴过夜+将上述连接产物转化大肠杆菌ARH&!涂布于含有氨苄青霉素!U&3,-和Q@O的?C琼脂平板!于;F]温箱中倒置培养!0!随机挑取白色菌落进行筛选+挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的?C培养液中!;F]振荡培养过夜+利用质粒提取试剂盒制备质粒!然后对其进行酶切和@/=鉴定+同时!进行测序鉴定!正确的重组质粒命名为SOIW&&Y7@*@#F&!;%+将测序正确的阳性克隆质粒经+/%%J4;双酶切后!与经过+/%%J4;双酶切的SI&;,k#连接!并将连接产物转化到A95-%6C?!$AI;#菌株中!涂布于含有卡那霉素$$3%J?#!U&3,-和Q@O的?C琼脂平板!于;F]温箱中倒置培养!0!随机挑取白色菌落进行筛选+所得的克隆经+/%%J4;双酶切鉴定及测序鉴定!阳性克隆命名为SI&;,k#&Y7@*@#F&!;%+’K(K-!Y7@*@#F&!;%表达将鉴定正确的阳性表达载体菌株接种于含卡那霉素$$3%J?#的?C培养基中!;F]!!H*%J1+!培养至$E为\G#$\!加入Q@O$JJ(-%J?#诱导表达;-%和H0后进行PAP%@2OI观察诱导表达的情况!同时!空SI&;,k#的A95-%6C?!$AI;#诱导H0作为空白对照+’K(K/!Y7@*@