考马斯亮蓝法测蛋白质含量(1)

考马斯亮蓝法测定——蛋白质含量一、实验目的。⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原理与方法。⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。•双缩脲法和Folin—酚试剂法的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮蓝法出现背景二、实验原理★考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕红色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。★在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质浓度成正比★实验优点（1）灵敏度高。据估计比Lowry法约高四倍，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K、Na、Mg2离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。★实验缺点（1）Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）标准曲线也有轻微的非线性。因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。三、实验器材与试剂⒈器材。可见分光光度计、试管、试管架、研钵、离心机、离心管、10ml容量瓶、刻度移液管、移液枪、小麦叶片或绿豆下胚轴。⒉试剂。⑴0.9％生理盐水⑵考马斯亮蓝试剂称取考马斯亮蓝G250100㎎，加95％乙醇100ml，溶解后加85％H３ＰＯ４，100ml，加水稀释至1000ml，存于棕色瓶。⑶蛋白质标准溶液准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置1000µg/ml标准溶液。四、实验步骤㈠标准曲线的制作取试管6只，按下表进行编号并加入试剂，充分摇匀。123456V（标准蛋白溶液）／µl020406080100V(0.9％生理盐水）／µl100806040200Ρ(蛋白质含量）／（µg／0.1ml)020406080100试管编号试剂每支试管加入3ml考马斯亮蓝试剂振荡混合后放置5分钟于595nm测定吸光度A595为纵坐标、标准蛋白含量横坐标绘制标准曲线㈡样品提取液中蛋白质含量的测定取3支试管，各吸蛋白提取液0.1ml，分别加考马斯亮蓝试剂3ml振荡混合放置5分钟以制作标准曲线的1号试管做空白对照，595nm测吸光度据所测A595值，于标准曲线上查出相当标准蛋白的量，取三重复样品蛋白含量均值㈢结果计算样品蛋白质含量=————————﹙µg／g鲜重﹚m为从标准曲线查得的蛋白质含量。m(µg)×提取液总体积（ml）所取提取液体积×样品鲜重（㈣、标准比较法取三只试管，按下表操作试管编号试剂待测管（U)标准管（S)对照管（B)V(样品提取液）／ml0.1____V（蛋白质标准液)ml—0.1V(0.9％生理盐水）／ml—__0.1V（考马斯亮蓝试剂）／㏕3.03.0混匀放5min3.0A595调零★样品蛋白质提取液含量m(µg)=Au／As×100五、注意事项⒈待测液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在100~800µg／ml为宜。⒉比色测定时，考马斯亮蓝易吸附在比色皿表面，对后续测定造成影响，因此测定结束后用无水乙醇清洗比色皿。预期结果•Brandford染色液和蛋白液在酸性条件下结合，溶液颜色由棕黑色转为蓝色。