第2章DNA重组(限制性内切酶与DNA片段化)

第二章DNA重组1.天然DNA的种类•染色体DNA•病毒和噬菌体DNA•质粒DNA•线粒体和叶绿体DNATMVT4噬菌体染色体DNA天然DNA的提取（自学）分子克隆实验指南(第三版)精编分子生物学实验指南2.限制性内切酶和DNA片段化•核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，才真正使DNA分子的体外切割和连接成为可能。这两种酶是基因工程赖以创立的重要的酶学基础。限制性内切酶•一类能识别dsDNA分子内部的特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸酶•来源：主要从原核生物中分离纯化而来•II型核酸内切酶：2300种以上，可识别230种不同的DNA序列（1994年，美国，分子生物学百科全书）目前发现有限制性内切酶的生物主要是细菌，少数霉菌和蓝藻。•这种大自然赋予基因工程学家的了不起的礼物是如何发现的呢2.1寄主控制的限制与修饰现象•大多数的细菌对于噬菌体的感染都存在这一些功能性障碍。•如：目前尚未发现有任何一种既可感染假单胞菌又可感染大肠杆菌的噬菌体，且非寄主细菌的RNA聚合酶不能够识别“外源”噬菌体的启动子，即使噬菌体的吸附和转录能进行，也仍然存在这另一种功能障碍——即为寄主控制的限制和修饰现象这种现象类似于人体的免疫系统，它可辨别自身的DNA和外来的DNA，并使后者降解——吴乃虎，基因工程（第二版，上册），P122限制——修饰现象Kλ（B）λ（K）λ（B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的λ噬菌体第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生长受寄主限制Kλ（K）存活下来的噬菌体再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已经对其进行了修饰）产生这种现象的原因何在甲基化酶：能使细胞自身核酸的内切酶识别序列的碱基甲基化，从而使自身核酸免受内切酶水解——细菌的“防御”系统核酸内切酶：识别并水解外源DNA（外来核酸在内切酶识别序列上没有甲基化修饰作保护）研究发现：原来是由两种酶配合完成，一种是起修饰作用的甲基化酶，另一种是核酸内切酶（1962年）限制修饰限制——修饰体系Kλ（B）λ（K）λ（B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的λ噬菌体Kλ（K）再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已经对其进行了修饰）λ（B）噬菌体感染大肠杆菌K菌株后，其DNA大部分被内切酶降解了，但有极少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成。•在限制修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；•而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。2.2分类核酸外切酶（exonuclease）核酸内切酶(endonuclease)核酸酶从核酸链的一端开始，一个接一个地消化降解核苷酸从核酸链分子内部切割3’，5’磷酸二酯键，使之断裂形成小片段核酸内切酶(endonuclease)：按限制性酶的组成、限制和修饰活性、切断核酸的情况不同，分三类(I，II，III)，通常指的是II型。（教材P34）希腊文exo为外部之意，endo为内部之意。限制性核酸内切酶的类型24-26bp处特异性切割随机性切割距识别序列下游识别序列内或附近距识别序列1kb处切割位点无规律旋转对称序列无规律识别序列ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM辅助因子异源二聚体同源二聚体异源三聚体蛋白结构双功能单功能多功能限制修饰III型II型I型主要特性2.3命名HindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶如从流感嗜血杆菌d菌株（Haemophilusinfluenzaed）先后发现3种限制性酶，则分别命名为HindI，HindII，HindIII大肠杆菌R菌株REscherichia嗜血流感杆菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名（型号）种名属名coli2.4基本特性•识别并切割双链DNA（环状或线状）分子中4－8bp的特定序列（回文序列）•切割产生的单链断裂部位在DNA分子上的分布通常并不彼此直接相对（粘性）•断裂形成的DNA片段，往往具有互补的单链延伸末端2.5内切酶识别序列的特征①长度：4－8bp②结构特征：双重旋转对称的回文结构③切割后产生的末端：粘性末端3-OH，5－P或平末端EcoRI的识别序列5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的切割位点①序列长度：多数为6bp4：Sau3AIGATC5：EcoRIICCWGGW=AorTNciICCSGGS=CorG6：EcoRIGAATTCHindIIIAAGCTTBamHIGGATCC6•NotIGCGGCCGC8•BbvCICCTCAGC7•PpuMIRGGWCCY7R=AorGY=CorT②结构•多为双重旋转对称的回文结构，产生的末端为平末端或粘性末端。•如：ABCC’B’A’A’B’C’CBA大写字母代表核苷酸，带撇的大写字母代表互补的核苷酸，垂直线代表对称轴或ABN’B’A’A’B’NBA或ABB’A’A’B’BA回文序列：指在双链DNA序列中按确定的方向阅读，双链中的每一条链的序列都是相同的。二重旋转对称EcoRIGAATTCCTTAAGHindIIIAAGCTTTTCGAA•粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。•平末端的DNA片段则不易于重新环化。•5’…G-C-T-G-OHP--A-A-T-T-C-G-A-G…3’•3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’EcoRI的切割位点1：5’粘性末端：突出的单链末端为5’端（5’P）2：3’粘性末端：突出的单链末端为3’端（3’OH）5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI的切割位点•5’…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’•3’…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’PvuII的切割位点3：平末端：无突出的单链非对称AccBSICCGCTCGGCGAG识别序列出现频率•1/4n–4Nt=44=256–6Nt=46=4096稀切酶（rarecuttingenzymes）•在DNA分子中出现的几率低，故称之为稀切酶•识别序列：比较长；富含AT；富含GC同裂酶(isoschizomer)•酶来源不同，但具有相同的识别序列（切割位点可相同，也可不同）–切割位点不同，是不同的酶–切割位点相同，是相同的酶，来自不同生物同尾酶（isocaudamer）•来源各异，识别的靶序列也不相同，但切割后的DNA片段具有相同的黏性末端，这样的一组限制性内切酶称为同尾酶。2.6切割位点•DNA在限制性内切酶的作用下，使多聚核苷酸上磷酸二酯键断开的位置EcoRIICCWGG10(N)CGA(N)6TGC(N)12部分在两翼少数两侧/端多数在内部偏爱位点P42•切割位点两侧序列的核苷酸组成亦与切割效率有关，即某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割2.7反应系统•底物：纯，线性，有保护序列•酶：样品，识别序列的密度，容积活性•反应缓冲液•反应条件大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mMVolume20--100μl反应温度、时间37℃，1--1.5hr0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶1）DNA纯度：要求较纯因素：蛋白质、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿以及某些高浓度金属离子措施：增加酶的用量；扩大反应系统体积延长反应时间；添加亚精胺2.7.1底物2)DNA的甲基化程度•核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中，质粒DNA是来源于甲基化酶缺陷型的大肠杆菌菌株。这样制备的质粒DNA，其中的内切酶识别序列没有甲基化，不受限制。3）DNA分子构型效率：线性DNA分子大于超螺旋质粒DNA环状病毒DNA4）识别序列的侧面序列限制酶切割DNA，对识别序列两侧的非识别序列有长度要求，只含识别序列的寡核苷酸是不会被酶切的，故通常要在识别序列两侧多加若干个核苷酸试剂公司提供的包装说明书会标明酶活性单位数和容积活性，最佳作用条件2.7.2内切酶决定酶的用量酶本身的催化活性底物DNA的样品1.用量2酶活单位1个酶活单位：在最适反应条件下，在20l反应液中反应1小时，使1gDNA（标准DNA）完全消化所需的酶活性称为1个单位。（教材P43）1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1μg标准DNA（λDNA）所需的酶量容积活性：1μL酶液中具有的酶活性单位，即U/μL。Q：某公司产品——内切酶a标注为200U/μL，现有提取到50ug的λDNA，问：在最佳反应条件下反应1小时，需要多少体积的内切酶a？常规缓冲液pH，Mg++，DTT/β-ME，(10X)pH7.0-7.9(at25℃)Tris-HCl，乙酸①离子强度：NaCl高中低100mM50mM0③Mg++10mMMgCl2，MgAc2.7.3反应缓冲液对绝大多数限制酶来说，在pH=7．4的条件下，其功能最佳。•大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃•一部分为50-65℃少数25-30℃•高温作用酶于37℃时活性多数10-50%TaqI(65℃)10%，ApoI(50℃)50%销售商在产品说明中会标明最佳反应温度2.7.4反应温度2.8staractivity1、概念高浓度的酶（100U/g）、高浓度的甘油（5%）、低离子强度（25mM）、极端pH值(pH8.0)等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的staractivity现象低特异性：可在不是原来的识别序列处切割DNA是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点2、抑制staractivity的措施①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度②保证反应体系中无有机溶济或乙醇③提高离子强度到100～150mM(如果不会抑制的话)④降低反应pH至pH7.0⑤使用Mg++作为二价阳离子2.9DNA分子片段化单酶切双酶切部分酶切2.9.1单酶切法•环状DNA分子产生与识别序列数（n）相同的DNA片段且DNA片段的两末端相同•线形DNA分子产生n+1的DNA片段2.9.2双酶切法环状DNA分子完全酶切DNA片段数为两种限制酶识别序列之和n1+n2线状DNA分子完全酶切DNA片段数为两种限制酶识别序列之和加1n1+n2+1重组克隆载体pMD18-T-RIP双酶切电泳图M:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ1:BamHI和SacI双酶切后的重组克隆载体18-T-RIP1M6092.9.3、部分酶切•指选用的限制性酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。•原因：底物DNA纯度低识别序列的甲基化酶用量的不足反应缓冲液不适宜温度不适宜反应时间不足缺点：影响需要的DNA片段的得率优点：根据重组设计的需要，专门创造部分酶切的条件，获取需要的DNA片段限制性内切酶反应的终止•消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温浴5分钟。1、限制酶十分昂贵！2、限制酶在50%甘油中保存于-20℃最稳定3、尽量减少反应中的加水量4、延长消化时间可使所需酶量减少使用限制酶的注意点：