中药化学成分的系统预试验

中药化学成分的系统预试验中药中所含的化学成分比较复杂，在研究某中药的化学成分之前，一般应先进行预试验，初步了解其中可能含有哪些类型的成份，以便对提取、分离工作提供有益的参考，预试验一般可分为两大类：一类是单项预试验，即可根据需要，重点检查某类化学成分的存在与否；另一类是系统预试验，即选用定性试验及薄层层析等方法，对中药中各类化学成分进行比较全面的检查，然后进行综合分析，初步判断有或无那些成分存在。预试验的结果一般只能作为参考，这是由于有些定性试验不是某类化学成分的特效、专一反应，同时在进行试验时，几种化学成分之间会发生相互干扰，使反应结果呈假阳性，故常须对某些类型化学成分进一步做层析法（TLC或PC）检查，才能进一步作出较恰当的判断。一、实验目的1、学习中药化学成分的系统预试验原理及方法。2、掌握中药化学成分的系统预试验程序及结果判断。二、实验原理根据中药中所含各类化学成分在不同极性的溶剂中溶解度不同。先选用不同极性的溶剂把溶解度相近的成分提取出来，分成极性不同的几个部分，即供试液；然后再选用各类成分的定性反应（包括沉淀反应和显色反应等）及层析法（TLC、PC等）检查，最后进行分析判断，初步确定有无哪几类化学成分。三、实验内容（一）预试验溶液的制备1、水提取液(1)冷水浸液：称取样品粗粉5g，置于l00ml的三角烧瓶中，加蒸馏水50-60ml室温浸泡过夜。过滤出约20ml滤液供检查氨基酸、多肽、蛋白质用。(2)热水提取液：将上述剩余的冷水浸泡液连同滤渣于水浴上60℃左右热浸半小时，趁热过滤，滤液供检查糖、多糖、有机酸、皂甙、甙类、酚类、鞣质等成分用。2、乙醇提取液另称取样品粗粉10g，置于250ml圆底烧瓶中，加95%乙醇100ml，于水浴上加热回流一小时，稍冷后加入蒸馏水使其含醇量为70%，冷至室温，过滤，滤液转移至分液漏斗中；用100ml石油醚（60-90℃）分两次萃取，每次用石油醚50m1，以除去叶绿素等，分出下层乙醇提取液，浓缩至40-50ml，加95%乙醇50ml溶解后过滤，滤液供检查黄酮、蒽醌、香豆素、萜类、甾体化合物、内酯化合物、强心甙、有机酸、酚类、鞣质等成分用。3、酸性乙醇提取液称取样品粗粉2g，加0.5%硫酸的乙酸溶液10ml，于水浴上加热回流10分钟，过滤，滤液供检查生物碱用。4、石油醚提取液称取样品粗粉1g，加入石油醚（60-90℃）10ml，滤液供检查挥发油、油脂、萜类、甾体化合物等成分用。（二）各类成分的检查1、检查生物碱类取上述酸性乙醇提取液先用稀氨水调至中性，再于水浴上蒸干，残渣加5%硫酸5ml溶解后，过滤，滤液供以下实验用。(1)碘化铋钾试验：取滤液1ml，加入碘化铋钾试剂1-2滴，如有桔红色沉淀产生，即表示可能有生物碱。(2)碘化汞钾试验：取滤液1ml，加入碘化汞钾试剂1-2滴，如有浅黄色或白色沉淀产生，即表示可能有生物碱。(3)硅钨酸试验：取滤液1ml，加入硅钨酸试剂1-2滴，如有浅黄色或灰白色沉淀产生，即表示可能有生物碱。2、检查氨基酸、多肽和蛋白质类(1)加热沉淀试验：取冷水浸液1ml，加热煮沸，如产生浑浊或沉淀，即表示可能有蛋白质。(2)双缩脲试验：取冷水浸液1ml，加入10%氢氧化钠水溶液2滴，摇匀，再滴加0.5%硫酸铜水溶液1-2滴，摇匀，如显红色，红紫色或紫色，即表示可能有多肽、蛋白质。(3)茚三酮试验：取冷水浸液1m1，加入0.2%茚三酮乙醇溶液2-3滴，摇匀，于沸水浴中加热5分钟，冷却后，如显蓝色或蓝紫色，即表示可能有氨基酸、多肽和蛋白质。(4)吲哚醌试验：取冷水浸液滴于滤纸片上，干燥后，喷洒吲哚醌试剂，于120℃加热5分钟，若斑点显各种颜色，即表示可能有氨基酸。3、检查还原糖、多糖和甙类(1)斐林反应：取热水提取液1ml，加入新配制的斐林(Fehling)试剂4-5滴，在沸水浴上加热5分钟，如产生砖红色沉淀，即表示有还原糖或其它还原性物质。若现象不明显，可另取热水提取液4ml，加入10%盐酸1ml于水浴上加热10分钟使其水解，冷却后，若有沉淀应过滤，然后加入5%氢氧化钠水溶液调至中性，再加入斐林试剂1ml于沸水浴上加热5分钟，如产生砖红色洗淀，即表示可能有多糖或甙类。(2)α-萘酚试验：取热水提取液1ml，加入5%α-萘酚乙醇液2-3滴，摇匀，沿试管壁缓缓加入浓硫酸lml，在试液与硫酸的交界面产生紫色或紫红色环，即表示有糖类，多糖或甙类。(3)多糖的试验：取热水提取液5ml，于水浴上蒸发至1ml，再加入95%乙醇5ml，若生沉淀，过滤，用少量乙醇洗涤沉淀，再将沉淀溶于3ml水中，加入10%盐酸1ml，于水浴上加热10分钟使其水解，冷却后，加5%氢氧化钠水溶液调至中性，然后加入斐林试剂1ml，于沸水浴上加热5分钟，如产生砖红色沉淀，即表示有多糖。4、检查皂甙类(1)泡沫试验：取热水提取液1-2ml置于试管中，密塞，激烈振摇2分钟，如产生大量持续性泡沫，且放置10分钟以上，或加热，或加入乙醇泡沫均无明显地减少，即表示可能有皂甙。(2)醋酐－浓硫酸反应：取热水提取液2ml，置于小瓷蒸发皿中，于水浴上蒸干，残留物加冰醋酸1ml溶解，再加醋酐1ml，浓硫酸1滴，如反应液颜色由黄→红→紫→蓝→污绿色，即表示可能有甾体皂甙，如反应液颜色由黄→红色不呈污绿色，即表示可能有三萜皂甙。(3)溶血试验：取热水提取液滴于滤纸片上，等干燥后，喷洒红细胞悬浮液，数分钟后，在红色背景中如出现白色或淡黄色斑点，即表示可能有皂甙。5、检查有机酸类(1)pH试纸试验：取热水提取液及乙醇提取液，分别用pH试纸检查其pH值，如呈酸性，即表示可能有游离羧酸或酚性化合物。(2)溴酚蓝试验：取乙醇提取液滴于滤纸片上，待干燥后，喷洒0.1%溴酚蓝的70%乙酸溶液，如在蓝色背景上显黄色斑点，即表示可能有有机酸。若斑点不明显，可再喷洒氨水，然后暴露在盐酸蒸汽中，背景逐渐由蓝色变黄色，而有机酸斑点仍显蓝色。溴酚蓝变色范围是：3.0（黄色）~4.6（紫色）。(3)溴甲酚绿试验：取乙醇提取液滴于滤纸片上，等干燥后，喷洒0.04%溴甲酚绿乙醇溶液，如蓝色背景上显黄色斑点，即表示可能有有机酸。溴甲酚绿变色范围是：3.8（黄色）~5.4（蓝色）。6、检查酚类化合物和鞣质类(1)三氯化铁试验：取热水提取液及乙醇提取液各1ml，（若提取液为酸性，可直接进行检查，若为碱性应先加醋酸酸化），加1%三氯化铁试剂1~2滴，如反应液呈绿色、蓝绿色、墨绿色、蓝紫色，即表示可能有酚类化合物或鞣质。(2)三氯化铁-铁氰化钾反应：取热水提取液及乙醇提取液分别滴于滤纸片上，待干燥后，喷洒三氯化铁-铁氰化钾试剂，如斑点呈蓝色，即表示可能有酚类、鞣质或还原性化合物。(3)香草醛-盐酸反应：取热水提取液及乙醇提取液分别滴于滤纸片上，待干燥后，喷洒香草醛-盐酸试剂，如斑点呈不同程度的红色，即表示有间苯二酚和间苯三酚类的化合物。(4)明胶试验：取热水提取液1ml，加入氯化钠-明胶2-3滴，如有沉淀产生，即表示可能有鞣质。7、检查甾体及三萜类化合物(1)醋酐-浓硫酸反应：取乙醇提取液2ml，置于小瓷蒸发皿中，于水浴上蒸干，残留物加冰醋酸1ml溶解，再加醋酐1m1，然后滴加浓硫酸1滴，如反应液颜色由黄→红→紫→蓝→污绿色，即表示可能有甾体化合物；如反应液颜色仅由黄→红→紫红色，即表示可能有三萜类化合物。(2)氯仿-浓硫酸反应：取乙醇提取液2ml，置于小瓷蒸发皿中，于水浴上蒸干，残留物加氯仿1ml溶解，并转移至小试管中，沿管壁加入浓硫酸1ml，如氯仿层显红色或青色，硫酸层于紫外光灯下观察有绿色荧光，即表示可能有甾体化合物。8、检查黄酮类化合物(1)盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液1ml，加入镁粉少许，再加入浓盐酸2-3滴（必要时水浴加热），如反应液或产生的泡沫显红→紫红色，即表示可能有黄酮类化合物。(2)三氯化铝反应：取乙醇提取液滴于滤纸片上，待干燥后，喷洒1%三氯化铝乙醇溶液，如斑点呈黄色，于紫外灯下检视呈明显的黄色或黄绿色荧光，即表示可能有黄酮类化合物。(3)氨熏试验：取乙醇提取液滴于滤纸片上，待干燥后，置于浓氨水瓶上熏半分钟，如斑点显黄色或黄色加深，当滤纸片离开氨蒸汽数分钟后，黄色减弱或消褪；另将氨熏后的滤纸置于紫外光灯下检视，斑点呈黄色荧光，即表示可能有黄酮类化合物。9、检查内酯、香豆素及其甙类(1)荧光试验：取乙醇提取液滴于滤纸片，待干燥后，于紫外灯检视，如斑点呈蓝色荧光，喷洒1%氢氧化钾试剂后斑点有荧光颜色转变为黄绿色，即表示可能有香豆素及其甙类。(2)重氮化反应：取乙醇提取液1ml，加入3%碳酸钠水溶液1ml于沸水浴加热3分钟，冷却后，加入新配制的重氮化试剂1-2滴，如显红色，即表示可能有香豆素及其甙类。(3)异羟肟酸铁反应：取乙醇提取液1ml，加7%盐酸羟胺甲醇液3-5滴和10%氢氧化钾液10滴，于水浴上加热至反应开始（有气泡产生），冷却，再加入5%盐酸使成弱酸性，加1%三氯化铁水溶液5滴，如反应液有橙红色或紫红色出现，即表示可能有酯类、内酯类、香豆素及其甙类。10、检查强心甙类(1)3,5-二硝基苯甲酸反应（Kedde反应）：取乙醇提取液1ml，加3,5-二硝基苯甲酸试剂3-4滴，如反应液呈红色或紫色，即表示可能有强心甙。(2)碱性苦味酸反应（Baljet反应）：取乙醇提取液1ml，加碱性苦味酸试剂1-2滴，如反应液呈橙色或红色，即表示可能有强心甙。(3)亚硝酸铁氰化钠反应（Legal反应）：取乙醇提取液1ml，置于小瓷蒸发皿中，于水浴上蒸干，残留物加吡啶1ml溶解，再加0.3%亚硝酸铁氰化钠溶液4-5滴，混匀，再加入10%氢氧化钠溶液1-2滴，混匀，如反应液呈红色，且颜色又逐渐消退，即表示可能有强心甙。11、检查蒽醌类(1)碱液试验（Borntrager反应）：取乙醇提取液1ml，加入10%氢氧化钠水溶液1ml，如反应液呈红色，再加入30%过氧化氢5滴，加热后，红色不消退，用5%盐酸化后，如红色消退，即表示有蒽醌及其甙类。(2)醋酸镁反应：取乙醇提取液1ml，加1%醋酸镁甲醇溶液l-2滴，如反应液呈红色，即表示有蒽醌及其甙类。(3)硼酸溶液试验：取乙醇提取液滴于滤纸片上，待于燥后，喷洒1%硼酸水溶液，如斑点呈橙黄色或红色，且于紫外灯下检视有荧光，即表示有蒽醌及其甙类。12、检查挥发油、油脂类(1)油斑试验：取石油醚提取液滴于滤纸片上，如油斑在室温下可挥发不留痕迹，即表示可能有挥发油；如油斑不消失，即表示有油脂类。(2)磷钼酸试验：取石油醚提取液滴于滤纸片上，喷洒25%磷钼酸乙醇液，115-118℃加热2分钟，如斑点呈蓝色，背景为黄绿色或藏青色，即表示有油脂、三萜及甾醇类。(3)香草醛-硫酸试验：取石油醚提取液滴于滤纸片上，喷洒香草醛60%硫酸试剂，如斑点呈红、蓝、紫等各种颜色，即表示可能有挥发油、萜类和甾醇类。（三）园型滤纸层析法取一张园型滤纸，在距园心1.0-1.5cm周围用毛细管点加样品，一张滤纸可同时点6-8个样品，待点样溶剂挥发后，在滤纸园心处穿入一滤纸芯，然后放在合适的培养皿中，使纸芯与培养皿中的展开剂接触，于园型滤纸上加盖培养皿盖，进行层析。当溶剂前沿接近培养皿边缘时，取出滤纸，挥干溶剂后显色，根据样品斑点颜色，可确定样品中的成分。1、检查有机酸类展开剂：95%乙醇样品：a.热水提取液b.乙醇提取液c.柠檬酸乙醇溶液（对照品）显色剂：0.1%溴酚蓝试剂，有机酸斑点呈黄色。2、检查挥发油类展开剂：95%乙醇样品：a.乙醇提取液b.石油醚提取液显色：先观察滤纸上有无油迹斑点，如有油迹斑点，可将滤纸加温烘烤，若油斑消失，则表示有挥发油存在。（四）各类成分的层析检查中药化学成分的预试验除用上述的定性反应外，还可用层析法进行，它不仅可以减少成分间的相互干扰，展析结果容易判断，还可以根据层析所用的条件加展开剂的组成，层析种类以及色斑的比较值（Rf值），初步判断样品中所含化学成分的极性大小和溶解性能，甚至可以通过和标准样品对照，初步确定样品中含有何种化合物。用层析法预试各类化学成分的参考层析条件如下：生物碱类：1、氧化铝层析（中性、碱性）展开