杂交技术

第三节核酸分子杂交技术按碱基互补配对原则，具有一定同源性的两条核苷酸单链在适宜条件下形成双链杂交过程具有高度特异性（即使有一个碱基不配对都不能杂交）。通过检测探针是否发生了杂交及杂交量多少，从而对待测核苷酸序列进行定性和定量分析。核酸分子杂交的成败，关键在于探针。核酸分子杂交技术的基本原理1.探针的概念：•在化学及生物学意义上的探针(Probe)，是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子，并可被特殊的方法所探知•核酸分子探针则是指带有标记物，能与互补核酸序列退火杂交的特定已知核酸片段。•探针的设计和选择影响核酸杂交实验结果的高度特异性、正确性。(一)探针的概念、种类及其选择、探针的标记2.探针的种类、选择及特点种类：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针选择：寡核苷酸探针是指人工合成的短链核苷酸片段，并带有标记物特点：人为控制，杂交时间短，特异性高，可以用于点突变检测；缺点是灵敏度低设计寡核苷酸探针遵循的原则：①探针长度：一般要求10～50bP。过短则特异性降低，过长，则合成困难、杂交时间延长，亦会出现非特异性杂交②G：C碱基对含量应占40～60％；过少，则不易杂交，或杂交双链不稳定；过多，则会产生非特异性杂交③探针内部的互补碱基对不应大于4bP，否则会形成探针内部的“发夹”结构。④同一碱基的连续出现次数不应超过4次⑤探针设计完后，最好利用基因库软件进行分析，并与已知的各种基因序列进行同源性比较，探针与非目的基因序列有70％以上的同源性，或连续有8个以上的碱基序列相同，则放弃。一种理想的标记物应具备的特性：①高度灵敏性；②标记物不影响探针的碱基配对特异性、杂交特异性、杂交稳定性及Tm值；③高度特异性（发生杂交能检测到，否则检测不到）；3.探针的标记物与标记④较高化学稳定性，保存时间较长；⑤标记方法及检测方法简单；⑥对人体无损伤，对环境无污染；⑦价格低廉。3.探针的标记物与标记放射性核素标记：32P、35S、3H、125I、131I优点是灵敏度极高，可以检测到10-14g～10-18g物质；缺点是对人体有一定影响，对环境有污染。非放射性标记物：半抗原（生物素、地高辛）；配体；荧光素；化学发光物；产生颜色的物质固相杂交膜上印迹杂交细胞原位杂交液相杂交（二）杂交用印迹技术将凝胶电泳分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上（转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变）。再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置及量的多少。膜上印迹杂交的基本操作流程1.印迹技术印迹技术是指将待测核酸分子转移并结合到一定的固相支持物上的方法。印迹技术主要包括两个关键因素：选择良好的固相支持物；有效的转移方法。⑴固相支持物的选择①具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性强，以便操作时不易损坏；②具有较强的结合核酸分子的能力；结合的稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程，而不会脱落或脱落极少；③结合后应不影响核酸分子与探针分子的杂交反应；④非特异性吸附较少，即使有，在洗膜时也易被洗脱掉。硝酸纤维素滤膜尼龙膜化学活化膜滤纸目前常用的固相支持物硝酸纤维素滤膜具有较强的吸附结合单链DNA和RNA的能力特别是在高盐浓度，其结合力可达80μg/cm2～100μg/cm2。这种结合主要靠疏水作用。非特异性吸附核酸（探针）能力较弱，因此杂交信号本底值较低。缺点：①与核酸的结合力较弱（因为是靠疏水作用），在杂交及洗脱的进程中，核酸会慢慢脱落，特别是在高温情况下，更容易脱落。对于小分子量DNA片段结合力更弱，因此不太适合小分子DNA片段的杂交。②硝酸纤维素膜质地较脆，特别是经烘烤后更易破损，因此操作不方便，须特别小心。硝酸纤维素膜与核酸的结合，有赖于高盐浓度，而高盐溶液又不适合于电转印迹法尼龙膜•未经特殊处理的尼龙膜，叫普通尼龙膜。经过了正电荷基团修饰的，又叫特殊尼龙膜。•特殊尼龙膜带有正电荷，对核酸的结合力要比硝酸纤维素膜强好多倍。•经短波紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的带正电荷的氨基相互交联。因此特别适用于小分子核酸片段的杂交。•碱处理也可使核酸牢固地结合在尼龙膜上，特别适用于菌落原位印迹法。尼龙膜质地坚韧，不易损坏，操作方便，可进行多次重复杂交。在低离子强度条件下，也可与核酸牢固结合，因此适用于电转印迹法。缺点：由于结合力强，非特异性吸附较多，杂交信号本底较高，应注意封闭。⑵印迹方法①斑点或狭缝印迹②虹吸印迹法③电转印迹法④真空转移法Southern印迹法Northern印迹法a.DNA分子经限制内切酶酶切。酶切变成合适长度的DNA片段。一般理想是0.5～10Kb，因片段大小直接影响转移效率。b.在琼脂糖凝胶中进行电泳。分离DNA片段，与DNA分子量标准参照物比较（Marker）,EB染色后观察DNA片段大小Southern印迹法c.将凝胶浸泡于适量的变性液中(1.5mol/LNacl和0.5mol/LNaOH)室温1h，其目的使DNA变性，即将双链DNA变成单链DNA。如果DNA片段较大(大于15kb)，可在变性前，用稀盐酸（0.2mol/L）处理10min,因为片段的大小直接影响转移率速。小于15Kb，转移1h。d.印迹(转移)方法：虹吸印迹法，电转印迹法和真空印迹法。不论采用哪种方法，均是将DNA从凝胶转移到固相支持物上e.固定，对于硝酸纤维膜，可真空下80℃烘烤2h(亦可无真空)，对尼龙膜还可用短波紫外线（波长254nm）照射几分钟进行固定。基本原理与Southern印迹相同但RNA变性方法与DNA不同:不能用碱变性，因为碱导致RNA水解。RNA的变性常与电泳同时进行，常有3种方法:•聚乙醛和二甲基亚砜变性电泳•甲醛变性凝胶电泳•甲基氧化汞电泳Northern印迹法RNA经变性电泳后，一般可进行转移（印迹），其印迹方法与Southern方法相同。对含甲醛的凝胶，可用DEPC预处理水漂洗，以去除甲醛。固定方法，常用真空烘烤（80℃）2h2．杂交（固－液相杂交）技术DNA分子杂交实际上是双链DNA的变性和具有同源序列的两条单链的复性过程。RNA分子杂交也涉及变性和复性过程（这种变性是单链RNA分子内部发夹结构打开过程）。因此以DNA分子杂交为例进行介绍。（1）变性即打开DNA双螺旋结构，变成单链DNA的过程。方法有：加热变性有机溶剂变性高浓度盐变性碱变性等常用方法是加热变性和碱变性。DNA变性时，在260nm处的紫外吸光度增加，这种现象又称增色效应。熔解温度（meltingtemperatureTm值）当增色效应达到最大值的50%时温度Tm值表明DNA溶液中一半的DNA双链已解离为单链Tm值反映了DNA变性的程度和难易，Tm值越大，变性越难大多数DNA的Tm值在85～90℃左右。Tm值的影响因素：①DNA的碱基组成，Tm值主要受G：C碱基对数量多少的影响，有一个经验公式为：Tm＝(G+C)%×0.41＋69.3②溶液的离子强度，DNA链上的磷酸基团带负电荷，在无盐的水中，DNA在室温条件下就会变性，而加入盐后，正电荷离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA双链的稳定性增加，Tm值亦会升高。③pH值，pH值在5～9之间范围内，Tm值变化不明显，当pH值大于11.3时，所有氢键均被破坏，DNA完全变性。这就是碱变性的原理。④变性剂：变性剂可以干扰碱堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲。通常用50％的甲酰胺使Tm值降低30℃（2）复性单链核酸重新缔合成双链的过程。复性的过程是相当复杂的。复性则需要相对较长的时间才能完成。分子碰撞机率越大，复性速度越快，一开始往往错误碰撞，只有正确配对才是复性的开始。使变性DNA完全恢复天然的双链结构，则要在低于Tm值25℃的温度下维持相当长的时间才能完成。复性的（速度）过程的影响因素：①DNA的浓度：DNA浓度越大、碰撞机率越大，复性速度越快。②DNA的分子量：大分子量的DNA扩散速度较慢，碰撞机率较少，同时又很难形成正确配对，因此复性速度较慢。③温度：温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；而温度过低，碰撞机率减少，易形成局部错误配对，适宜的温度是较Tm值低15℃～25℃。④离子强度：离子强度过低，不利于复性⑤pH值：pH值在5～9范围内，不影响复性速度，过低或过高则影响。⑥DNA分子的复杂性：DNA总量一定时，基因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数就越少，互补顺序的浓度就越低，因而复性反应速度越慢。（3）杂交体系的建立要考虑以下几因素①DNA浓度：DNA浓度越高，复性速度越快。加入足够的DNA并尽量减少杂交的体积，一般以每平方厘米滤膜面积加50～100μl杂交液为宜。②DNA探针的长度：在杂交过程中，待测DNA固定在膜上，只有探针可以自由扩散，探针越长，扩散越慢，变性越慢。因此探针的长度不宜过长，一般以10～50bp。③离子强度：离子强度对变性影响较大。一般常用5×或6×SSC（1×SSC为0.15mol/LNacl和0.015mol柠檬酸钠）。④温度：温度对于杂交（复性）反应的快慢和洗膜时去掉非特异杂交是至关重要的因素。一般认为杂交温度为：68℃（不含甲酰胺）；当含50％甲酰胺时，在42℃进行杂交。洗膜温度一般认为55℃～65℃。对于寡核苷酸探针的杂交温度，应根据下列公式推算：Tm=4℃×GC＋2℃×AT杂交温度一般比Tm值低5℃，55℃（20bp)⑤杂交时间：一般应为Cot1/2的1～3倍。Yz小时/Cot1/2＝×25×10XCo＝单链DNA浓度，t1/2＝反应一半的时间Y为探针DNA的复杂性，即片段大小（Kb）Z为杂交体系的体积(ml)。经验杂交时间8～16h，过夜。⑥减少或抑制非特性杂交。一般在杂交前先进行预杂交，以便将非特异性DNA位点封闭，同时也将膜上非特异性吸附位点封闭。⑦促进杂交反应速度：硫酸葡聚糖(dextransulfate,Mw500000)能促进DNA链间的缔合，其微粒表面可吸附DNA探针分子，从而使DNA接触面积增大，有利于杂交反应，促进杂交反应速度。如10％硫酸葡聚糖可使杂交反应速度提高10～100倍。①预杂交：将膜放在预杂液中，即不放探针，预杂交液中主要含Dehardt液和鲑鱼精DNA，主要是封闭膜上非特异性的杂交位点。②杂交：杂交液中除含封闭物质外，还含有10％硫酸葡聚糖和探针。探针如果是双链DNA，则需要进行变性处理。温度68℃（不含甲酰胺），42℃（含50％甲酰胺），杂交时间：8～16h过夜。（4）杂交操作步骤③洗液：将膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针从膜上洗去的过程。由于非特异性杂交的杂交体稳定性较低，解链温度较低，而特异性杂交体由于稳定而保留在滤膜上。注意，洗膜液要换几次，要用几种不同的洗膜液。离子强度逐渐降低，而洗膜温度逐渐上升（室温～37℃～65℃）。即逐渐增加洗膜的强度。逐渐减少离子强度，为下一步反应（检测）做好准备。3．杂交信号的检测⑴放射自显影：探针标记了放射性核素，如32P、35S、125I或131I。其具体方法是：在暗盒里将杂交后的滤膜放在暗盒里的X光片上，盖上暗盒，置－70℃曝光一定时间。经显影、定影后，可出现黑色曝光斑点，根据斑点密度及大小，判断被检测核酸是否有与探针相应序列及大小。⑵显色反应：探针直接标记酶或间接结合酶，酶在有特异性底物存在的情况下，可发生显色反应。根据显色反应斑点大小判断结果。ABC酶+底物显色探针标记物(地高辛)抗体常用的酶碱性磷酸酶：作用底物：BCIP（5-溴-4-氯-4-吲哚磷酸）NBT(硝基蓝四氮唑)。显色过程：碱性磷酸酶→BCIP→脱磷，产生H+→NBT还原→紫色化合物。辣根过氧化物酶（HRP）：常用的底物：DAB（二氨基联苯胺），红棕色，有致癌性。TMB（四甲基联苯胺），产生蓝色，无致癌性。⑶化学发光反应与显色反应基本一致，只是酶（HRP碱性磷酸酶）催化一种特殊底物如luminol、CSPD等，产生发光，而不