第二部分DNA重组技术A

重组DNA技术--基因重组与基因工程基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。基因重组技术作为分子生物学最重要、最基本的技术之一，是许多分子生物,生物化学和细胞生物学实验实施的基础。现代基因工程的创始人P·伯格（美国,1926－）在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。1973年，美国斯坦福大学教授S·科恩和加州大学旧金山分校教授H·W·博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。科恩随后以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。1977年，吉尔伯特（W·Gilbert）分别将编码胰岛素和干扰素的DNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。DNA重组的基本模式分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）“纵向”体系目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线(分)------目的基因及载体的分离需要克隆的DNA片段：化学合成法cDNA文库基因组DNA文库聚合酶链式反应目的基因的获取从基因所在生物直接取得--用限制酶剪切供体DNA--用机械的方法eg超声波化学合成法人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。较短的核酸片段（60-80bp）多肽链的氨基酸顺序mRNA的碱基排列顺序相应的基因结构化学合成目的基因化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。化学合成的不足之处在于：--要已知基因的核苷酸顺序；--基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；--价格昂贵。用途：PCR引物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针从基因文库中筛选将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomicDNAlibrary)。将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNAlibrary)。C-文库具有组织细胞特异性。从mRNA反转录合成cDNA构建基因文库获取目的基因存在的问题——费时费事内含子序列反转录人工合成互补DNA方法的优势——获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。载体DNA的选择理想载体的基本条件：可转移性,为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。合适的复制位点,为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源DNA质粒噬菌体腺病毒载体逆转录病毒载体……种类：质粒载体的一般结构存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点。DNA重组的基本模式分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）“纵向”体系切------限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切酶切载体和目的基因的切断通常采用限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesiveend)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。酶切--双酶切：体系：选择合适的缓冲体系，尤其是双酶切反应中。DNA：经过纯化的，尽量不含有蛋白质，酒精等杂质。时间：一般为5-7h，载体overnight以保证酶切完全。不能时间过长，以防止内切酶的star活性，降低特异性。酶切之后立即回收，小片段用PCR-purificationKit除去，大的片段要用切胶回收去除。T-vectorT-vector两条链的5’端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个ADNA重组的基本模式分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）“纵向”体系接------载体和目的基因的连接（一）粘性末端连接法：当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。载体DNA与目的基因的连接（二）人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。末端转移酶（terminaltransferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它所催化的反应与DNApolI相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段为引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。（三）人工接头连接法：将人工连接器（linker，即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子DNA片段，约10~20个核苷酸）连接到平末端DNA分子(载体和目的基因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。连接体系的建立：温度：粘末端连接：12-18℃(16-20hours)平末端连接：室温（低于30℃)DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：3-5酶量：平端连接时需加大酶量连接反应体系越小越好，相对而言，酶切体系稍大较好连接失败后--一步一步向上游检测问题所在，所以分子克隆部分“留一半”的原则有时候是很有用的。酶切是否完全，所以要做载体的自连对照。载体酶切回收是否考虑到切除片段的大小，是否要用切胶回收更保险。DNA重组的基本模式分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）“纵向”体系转------重组体的转化受体细胞重组体的转化宿主菌或受体细胞原核系统--大肠杆菌--枯草杆菌真核系统--酵母菌酵母--昆虫细胞--哺乳动物细胞原核细胞的转化（细菌转化）受体细胞的选择：限制缺陷型:避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染感受态细胞（competentcell）所谓感受态，就是细菌吸收转化因子的生理状态。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Competentcells）。大肠杆菌感受态细胞的制备(化学方法)大肠杆菌细胞大肠杆菌感受态细胞CaCl2处理目前常用的感受态细胞制备方法是CaCl2法,CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。二、感受态细胞的制备(CaCl2法)将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟。弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后，4℃下3000g离心10分钟。弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。感受态细胞的制备的操作步骤为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。大肠杆菌细胞大肠杆菌感受态细胞得到噬菌斑或单菌落与重组DNA共同冰浴而后42℃短暂热刺激CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2感受态细菌重组体转入细菌转化从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。向管中加入1mlLB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养