九大测序平台的比较

测序平台Sanger454SolidHiSeq2000企业LifeTechnologyRocheLifeTechnologyIllumina推出时间1977年发明，1986年第一台商业化测序仪2005年2007年2010年1月主流型号3730XLGenomeSequencerFLXTitanium（2008年推出）Solid™4.0（2010年推出）IlluminaHiSeq2000样品要求PCR产物：浓度≥50ng/ul体积≥10ul；质粒：含量≥5ug；菌液：体积≥1ml。5μgofDNA，浓度≥300ng/μL•Fragment文库10ng-5μg•Paired-end文库10ng-5μg•Mate-paired文库5μg-20μg6ug/sample,无RNA、蛋白污染，无降解，OD260/OD280=1.8-2.0测序原理双脱氧链终止法焦磷酸测序边连接边测序边合成边测序文库制备无需建库，提供质粒、菌液、PCR产物等均可以Fragment(300-800bp),Mate-pair•Mate-paired文库(插入片段600bpto10Kb)•Paired-end文库•Fragment文库Fragment,Mate-pair(200bp-40kb)模板制备PCR扩增微乳液PCR微乳液PCR桥式扩增读长500-1000bp400bp2*50bp50SE,91PE,101PE等测序通量四种测序方式的每天通量：短片段测序36cm36min500bp1,728,000bp/day；快速测序0.4-0.6Gb/run100-120Gb/run,12G/day25G/day时间/run36min-2hours10hours7~12days91/101PE,8-10days;50SE,3days;150PE,15days;总体来说，策略不同，时间也有差别碱基精确度99.999%Q20读长为400个碱基原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖深度时的准确度可以达到99.999%Q30%≥80%；Q20%≥90%变异检测能力(DNA重测序方面)heterozygousinsertionsanddeletions,microsatellite,SNP,AFLP,T-RFLP,andLOHanalysesSNP,Indel,SV,CNVSNP,Indel,SV,CNVSNP、Indel、SV、CNV成本$95,000permachine,about$4perreaction,800bpperreaction,仪器$500,000/台，测序$5,600perwholeplate仪器$495,000/台，测序$6000/100Gb$690,000permachine,$6000perhumangenomesequencing(30X)数据格式*.bcf；*.ablRawdata：SFF格式Rawdata:*csfasta和*quel；比对输出格式：BAM/SAM。测序结果：*.fq;比对：*。SOAP/*.BAM/*.SAM;变异：*.gff分析软件数据收集软件DataCollectionv2.0(随机提供)Managesyourinstrumentsetup,controlsinstrumentoperations,allowsreal-timedatavisualization,andperformsdiagnostics.Newfeaturesinclude:-Auto-analysiswithGSDeNovoAssembler软件；GSReferenceMapper软件；GSAmpliconVariantAnalyzer软件分析软件：Bioscope,比对后格式有很多第三方软件支持GenomeStudio或者第三方软件包；自主选择优点测序金标准，读长长突出优势是读长长，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得4-6亿个碱基对。高准确性，每个DNA碱基检测2次，增加了序列读取的准确性通量大，测序方式灵活，分析软件多样化缺点通量低，成本高无法准确测量同聚物的长度，所以检测插入缺失突变的误差率高；通量小且费用高。运行时间长，检测碱基替换突变的误差率高在成本上目前高于第三代测序，样本制备过程复杂，样本要求相对较高。经典案例Sanger测序属于测序技术的金标准，文章众多1.CompleteKhoisanandBantugenomesfromsouthernAfrica.SchusterSCetal.(2010)Nature463(7283):943-7.(更多详见测序技术仅在DNA应用发表的文章共60篇，包括发表在Science/Nature及其子刊上的高水平文章15篇，其中denovesequencing文章3篇，targetedresequencing文章26篇，wholeInitialgenomesequencingandanalysisofmultiplemyeloma.ChapmanMA,etal.Nature.2011Mar24;471(7339):467-72.Cytoplasmicintronsequence-retaining备注鉴于测序本身方法的局限，测序引物后10bp～40bp无法保证准确特别适合从头拼接和宏基因组学应用，多用于新的细菌基因组。对重测序来说太贵，不适合行业领先的准确性实现了重要的生物变异检测，适合全基因组重测序、定向重测序和全转录组分析等应用。是目前市场上最主流的测序仪器，democase众多；另外，Theadditionalbenefitisexperimentalflexibility-applicationsthatrequiredifferentreadlengthscanberunoneachflowcell–anHelicosDNANanoballarrayThePacBioRSsystemPGMMiSeqHelicosBiosciencesCompleteGenomicsPacificBiosciencesIonTorrentIllumina2008年2009年底Science论文发表,2010年推出2010年2月开始早期试用2010年2011年HeliScope™SingleMoleculeSequencer（2008年推出）DNANanoballarrayPacBioRSIonPersonalGenomeMachine™（2010年）MiSeqPersonalSequencingSystem（2011年）1-3μg，起始DNA体积不超过100μL.DNA由PicoGreen定量：推荐10ug，最少7.5ug。浓度:75-150ng/ul;体积：50-200ul;DNA长度：大分子量双链基因组DNA，大部分超过1kb以下500ng，纯化的基因组DNA,BACs,cDNA文库或PCR产物5µgDNA，起始DNA体积不超过130µL使用Nextera，50ngDNA；使用TruSeq，100ng–1µgDNA边合成边测序,可逆阻断测序边连接边测序边合成边测序，singlemolecule,real-time,orSMRT™,technology半导体芯片测序边合成边测序Fragment,Mate-pair500bpFragment,Mate-pair(250bp-6kb)Fragment(185–210bp)Fragment单分子检测纳米球（DNB）SMRTbell™libraryPCR扩增桥式扩增25-55bp，平均35bp35PE1000bp314芯片，100bp；316芯片，100bp；318芯片，200bp。1*35bp2*100bp2*150bp21to35Gb/run20-60G/run/flowslide,共18个flowslide高灵活性的测序通量314芯片，10Mb/run；316芯片，100Mb/run；318芯片，1Gb/run。1*35bp120Mb/run2*100bp680Mb/run2*150bp1Gb/run8days9days模板制备到primarybasecallanalysis只需不到一天,一般只需要不到4个小时.2hours扩增测序总时间：1*35bp4hours2*100bp19hours2*150bp27hours20X覆盖度时一致性超过99.995%99.999%准确率社会评价不高，2011年1月发表的NEJM杂志（关于海地霍乱的测序）在其supplementary提到它的单碱基准确率只有81-83%。一致性超过99.99%，99.5%rawaccuracy.90%baseshigherthanQ30at1*35bp80%baseshigherthanQ30at2*100bp75%baseshigherthanQ30at2*150bpSNP,CNVSNP、Indel、SV、CNVSNP、Indel、SV、CNV，可以直接进行甲基化等修饰测序，方便表观研究SNP,IndelN/A仪器$999,000/台，测序$0.45-0.60/Megabase.只提供测序服务，不出售仪器。09年11月的WGS成本为$1726（45×），$8005（87×）$700,000permachine，$99perSMRTTMCell,eachpatternedwith15,000ZMW,eachZMWcontainasingleDNApolymerase.仪器$50,000/台，测序$500/run仪器$125,000/台，测序$750/runRawdata：srf或者sms格式基础文本格式，*.tsv。可交付结果包括：序列变异、功能注释、数据总结报告及一整套上述结果的支持数据。bas.h5–BaseFileandFilteredBasesFile-Documentationcmp.h5–ReferenceMappedFileand标准的SFF或者FASTAQ格式*.bcl,FASTQ,BAM,*.vcf和*.csv.推荐用Helisphere开放资源软件进行过滤比对GenomecomparisontoolsFormatconversiontoolsAnnotationtoolsReferencetools，在开发中的还有用于癌症基因组分析的肿瘤-正常样本比对工具和用于家族基因组分析的工具，还有大规模比对工具可以同时比对数百个mapping：BLASR(BasicLinearAlignmentwithSuccessiveRefinement)；组装：ALLORA(ALongReadAssembler)；SNP和Indel：RCCS(ReferenceCircularConsensusSequencing)客户端软件：SMRTPortal；提一系列商业软件进行变异检测，denovo组装GenomeStudio或者第三方软件包；自主选择真正的单分子测序，无需前期扩增，不引入偏向性;特别适合RNA-Seq或RNA直接测序的应用，因为它能直接测序RNA模板，而无需将其转化成cDNA。检测碱基替换突变的误差率测序自动化，成本低，通量大读长长；无需PCR扩增，也避免了由此带来的bias；需要的样品量很少；样品制备时间花费少；用RS系统可以远程快速获取数据和选择测序参数；通量灵活；时间快无以伦比的快速，2个小时完成测序工作；IonTorrent的化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度。样品制备简单快速，在一台仪器上完成测序和数据处理；可靠的化学方法，可逆中止碱基边测序边合成法错误率高，Insertion1.5%，Deletion3.0%；Heliscope在面对同聚物时也会遇到一些困难，但可以通过二次测序提高准确度；由于在合成中可能掺有