第十三章基因工程与基因重组-PowerPointPre

第十三章基因重组与基因工程第一节自然界的基因重组一转化（transformation）1943年Avery等，研究肺炎双球菌时发现，有毒型肺炎双球菌的DNA和无毒型肺炎双球菌一起培养产生子代有毒型肺炎双球菌。病毒和噬菌体是最简单的生物，由蛋白质包裹着核酸组成。噬菌体感染宿主细胞后，噬菌体核酸进入宿主细胞过程叫转染（transfection），是转化的一种形是。如癌基因随病毒基因整合到宿主细胞的染色体中，癌基因被转录，并翻译为蛋白质，此特异蛋白质使正常宿主细胞转变为癌细胞。二转导（transduction）λ噬菌体感染大肠杆菌时，λDNA进入宿主细胞，与宿主细胞染色体重组成一体，叫作整合，整合的细菌叫溶原菌，另一种方式叫裂解。三转位（transposition）转位是一组基因从一处转位到基因组的另一个位置，免疫球蛋白的生产就是通过基因转位和重组而生产的过程。第二节基因工程基因工程是用分离纯化或人工合成的DNA，在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用于转化宿主（细菌或其它细胞），筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、转代、扩增，成为克隆（clong）。因此，基因工程也称为基因克隆（genecloning）或重组DNA技术。基因克隆（或重组DNA）技术，既然是个工程，就应有蓝图和施工方案。首先要考虑的是达到什麽目的，如是想扩增基因研究还是用此基因生产蛋白质。基因克隆技术示意图：一分——载体和目的基因的分离（一）载体常用的有质粒、λ噬菌体、M13噬菌体等。逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA，是近年用于插入动物细胞较新载体，这些载体多是在宿主细胞内可独立复制完整DNA分子。pBR322是常用质粒。λ噬菌体和噬菌体又称大肠杆菌噬菌体。λ噬菌体由可壳蛋白包裹着49502个碱基对的DNA，还有一个尾巴。λDNA共有50多个基因。（二）目的基因的来源1.直接从染色体中分离;2.人工合成;3.从mRNA合成cDNA;4.基因文库(genelibrary)。二切——限制性内切酶的应用有人把限制性内切酶称作基因工程的手术刀，它能识别核酸分子莫些碱基序列并加以切开。分平端切口和粘端切口。三接——把载体和目的基因接成重组基因限制性内切酶切割载体及目的基因后，无论产生平端切口或粘端切口，都可以用DNA连接酶把载体和目的基因接成重组基因。还有一种尾接法的连接方法，在载体和目的基因上找不到共同的酶切点时，采用此法。四转——重组体的转化重组载体如大肠杆菌质粒，可在0~4C°用CaCI2处理大肠杆菌，以增大其细胞膜的通透性，而后将用CaCI2处理的杆菌与重组质粒进行保温，使质粒进入菌体，将DNA片段导入宿主细胞进行转化。基因工程技术的发展，特别是高等动物的基因难于在原核生物体系中表达，因二者的转录、翻译系统各有差异，目前基因工程的表达体系已发站到第二、三、四代：五筛——DNA重组体筛选与鉴定将重组载体引入宿主细胞，并将其初步扩增后，应加以筛选，筛出含目的基因的菌株，并鉴定之，确定克隆株后，即可繁殖菌株进行扩增。1.据重组载体的表型进行是常用方法。可以利用载体质粒对抗生素的抗药性进行筛选。如质粒pBR332，由4362个核苷酸对构成对四环素及氨苄青霉素均有耐药性。2.DNA限制酶切图谱分析：如用快速的DNA提取法提取重组DNA，经限制性内切酶切割后，在琼脂糖凝胶电泳上比较重组体与原来载体，可以从DNA片段的大小与有无来区别是否已发生重组。3.利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：将菌落DNA转移到硝酸纤维素滤膜上，另外用放射同位素，标记目的基因，制成溶液，作为“探针”将菌落DNA与“探针”一起温育，若菌落含有目的基因，就可把“探针”吸附住，把已和探针溶液作用过的滤膜冲洗、烘干，与线底片夹在一起放阴暗处数天，经显影后，有目的基因的所在位置会出现黑点，从黑点位置与菌落DNA比较及鉴定之。基因工程是生命科学中目前的热门课题，方法日新月异，总的操作原则归纳如下：生物技术（biotechnology）即生物工程，是利用有机体或其组织发展新产品的一种技术。单克隆抗体（monoclonalantibody）是由一个杂交瘤细胞及其后代，产生的抗体，具有单一、特异与纯化的特性。第十三章作业1.写出下列物质的英文名称:生物技术生物工程转化转染转导转位基因克隆基因文库单克隆抗体2.基因工程技术操作方法可归纳为那几方面?