第一章Peprotech重组细胞因子(1)-第一章Pep

联科生物技术有限公司全国免费电话：8008571184全国免费电话：8008571184联科杭州：0571-88226558联科上海：021-64511079联科北京：010-51805911联科苏州：0512-68666623联科厦门：0592-53222277联科广州：020-83506317联科武汉：13995511341联科南京：025-866092941第一章重组细胞因子第一部分：确定重组细胞因子的交叉活性背景：现有各公司的商品化重组细胞因子以人源的细胞因子重组表达为主，小鼠和大鼠源的较少，猪、羊等的细胞因子就更少了。因此您在做动物实验时，经常会因找不到相应的细胞因子而苦恼。解决此问题的方法通常是向公司询问其人源或小鼠源的细胞因子是否对大鼠，猪等也有活性，公司一般会有较长的一个反馈时间，有可能会耽误您的宝贵时间。在这里简单的介绍一下如何自己确定重组细胞因子的交叉活性。方法：1.在公司的网站上查到您所要订购细胞因子的氨基酸序列2.用NCBI-BLAST2软件来比较蛋白的同源性3.同源性(序列一致性)在80%以上的基本上就可确定为有交叉活性举例：现以美国Peprotech公司的重组人PDGF-BB(产品编号：100-14B)为例，确定它与其它物种的PDGF-BB的同源性，进而得知是否有交叉活性。1.进入Peprotech公司网站---；2.在左上角的产品搜索(ProductSearch)处输入：humanPDGF-BB，查询人PDGF-BB；3.在查询结果中找到RecombiantHumanPDGF-BB(重组人PDGF-BB)并点击，进入如下界面：联科生物技术有限公司全国免费电话：80085711844.在上图中，找到重组人PDGF-BB的氨基酸序列，即AASequence，拷贝到剪贴板(Clipboard)；5.在浏览器内进入NCBI-Blast2蛋白数据库查询系统，网址为，界面如下：全国免费电话：8008571184联科杭州：0571-88226558联科上海：021-64511079联科北京：010-51805911联科苏州：0512-68666623联科厦门：0592-53222277联科广州：020-83506317联科武汉：13995511341联科南京：025-8660929426.上图的下部有一个空白输入框，将剪贴板中的重组人PDGF-BB的氨基酸序列粘贴到空白框中，出现下图：联科生物技术有限公司全国免费电话：8008571184全国免费电话：8008571184联科杭州：0571-88226558联科上海：021-64511079联科北京：010-51805911联科苏州：0512-68666623联科厦门：0592-53222277联科广州：020-83506317联科武汉：13995511341联科南京：025-8660929437.点击上图的RunBlast按钮，运行Blast，出现下面的界面，界面右侧的红色条纹不断的闪烁，且右上部出现Yourjobiscurrentlyrunning---pleasebepatient(你的任务正在执行---请耐心等待)；8.过约1分钟左右(时间的长短与您的计算机的处理速度和网络连接速度有关)，得出查询结果，如下图：联科生物技术有限公司全国免费电话：80085711849.上图的下表显示出Peprotech公司的重组人PDGF-BB与其它物种(包括人天然的PDGF-BB)的PDGF-BB的氨基酸序列一致性，在Identity%一列显示出；DB:ID列则给出PDGF-BB的来源物种，如HUMAN(人)、MOUSE(小鼠)、RAT(大鼠)、FELCA(猫)和SMSAV(类人猿肉瘤病毒)等；Source一列则是PDGF-BB的具体名称，注意有些可能不是PDGF-BB，如第一行的Orf2protein。10.从上图可见，Peprotech公司的重组人PDGF-BB与人天然的PDGF-BB、小鼠和大鼠的PDGF-BB的氨基酸序列一致性分别为98%、87%和87%，表明从理论上来讲Peprotech公司的重组人PDGF-BB对人、小鼠和大鼠细胞均具有较高的活性。11.若向下拖动上图的右侧标尺，则可看到更多结果(如下图)。从图中得知，Peprotech公司的重组人PDGF-BB与羊(Sheep)的氨基酸序列一致性分别也高达87%，说明，其对羊细胞也有活性，而对鸡(Chiken)的氨基酸序列一致性仅为67%，提示活性不强。全国免费电话：8008571184联科杭州：0571-88226558联科上海：021-64511079联科北京：010-51805911联科苏州：0512-68666623联科厦门：0592-53222277联科广州：020-83506317联科武汉：13995511341联科南京：025-866092944联科生物技术有限公司全国免费电话：8008571184全国免费电话：8008571184联科杭州：0571-88226558联科上海：021-64511079联科北京：010-51805911联科苏州：0512-68666623联科厦门：0592-53222277联科广州：020-83506317联科武汉：13995511341联科南京：025-866092945第二部分：重组细胞因子活性单位(units)的计算背景：各公司在开发出重组细胞因子并检测其活性后，经常会以ED50(半数有效浓度)或Units(活性单位)来标识其细胞因子的生物活性。ED50和Units究竟是如何计算出来的呢，两者之间又有何关系？ED50(半数有效浓度)：检测细胞因子的生物活性时，会选取梯度浓度的细胞因子，分别与检测细胞孵育一定时间后，用合适的方法，如MTT、XTT等方法检测结果，得出特定浓度的细胞因子对特定检测细胞的活性值。然后可绘出量-效曲线，即如下图，以细胞因子浓度为横坐标，以活性值为纵坐标作图得出直方双曲线图。若将细胞因子浓度改为对数值，即横坐标采用对数坐标(log)，则量-效曲线呈典型的对称S型曲线(下图中的小图)。在上图中可以确定特定浓度细胞因子所应产生的生物活性。更重要的是，通过量-效曲线可以计算出ED50，即半数有效浓度，其定义为诱导产生50%最大生物活性反应时所需的细胞因子浓度，如上图中所示的KD或小图中的1。了解ED50值对于确定您实验时的工作浓度大有裨益。联科生物技术有限公司全国免费电话：8008571184例[美国Peprotech公司的重组人IL-2(RecombinantHumanIL-2)]：进入Peprotech公司网站---，输入产品编号200-02，查找到RecombinantHumanIL-2，并点击进入其说明书，如下图：在生物活性(BiologicalActivity)一行可见，Peprotech的重组人IL-2是以小鼠的CTLL-2细胞为检测细胞，通过IL-2对其的诱导作用得出IL-2的生物活性，绘制量-效曲线后，计算出重组人IL-2的ED50为0.1ng/ml，即IL-2的浓度小于0.1ng/ml时使诱导作用达到最大反应的50%。简便计算方法：计算ED50的方法和软件均很多，这里介绍一种较实用的简便方法。1.登录网站(这是个日文网站，但相信您能大致看懂)；2.点击GradedResponseのED50,IC50(50%有効量)链接；3.在Input区域粘贴您的数据(您的数据可先在Word里输好，然后拷贝-粘贴到Input区域；4.然后按Calc按钮(即Calculate，计算)，在Output区域内即出现ED50结果,见下图。全国免费电话：8008571184联科杭州：0571-88226558联科上海：021-64511079联科北京：010-51805911联科苏州：0512-68666623联科厦门：0592-53222277联科广州：020-83506317联科武汉：13995511341联科南京：025-866092946联科生物技术有限公司全国免费电话：8008571184全国免费电话：8008571184联科杭州：0571-88226558联科上海：021-64511079联科北京：010-51805911联科苏州：0512-68666623联科厦门：0592-53222277联科广州：020-83506317联科武汉：13995511341联科南京：025-86609294765.78421.9737.29622.43380.81300.27200.0912浓度活性%活性单位(Units)：细胞因子的活性单位(Units)代表细胞因子刺激细胞生长、抑制细胞生长或杀伤细胞的能力，即细胞因子的生物活性。通常一种细胞因子对特定靶细胞的作用能力相同，因此待测样品中的活性单位数可代表样品中的细胞因子含量。活性单位的计算：细胞因子的活性检测结果可用能诱导50%最大反应的待测样品最高稀释度作为参考效价(或滴度)，也可将此稀释度中所含的细胞因子的量作为1个活性单位(Units,U)，因此此稀释度的倒数即为待测样品中所含细胞因子的单位数，下面举例说明：检测某细胞因子(如人IL-2)，倍比稀释后，分别取各浓度中的0.2ml来检测人IL-2对小鼠CTLL-2细胞的诱导增殖活性，然后根据量-效曲线测得人IL-2引起50%最大促增殖活性的最高稀释度为1/128。从上面的叙述可知，此人IL-2的效价，即滴度为1/128；0.2ml1/128倍稀释的IL-2中的细胞因子量为1Unit，因此0.2mlIL-2中含有1/(1/128)=128Units的细胞因子，那么可计算出1ml中所含的细胞因子量为128Units/0.2ml=640U，也就是说待检测的细胞因子浓度为640Units/ml。活性单位与ED50的关系：上面提到，待测样品中所含细胞因子的单位数为能诱导50%最大反应的待测样品最高稀释度的倒数。其实能诱导50%最大反应的待测样品的浓度即为ED50，对于Peprotech公司的细胞因子通常是用ng/ml表示。现还是以重组人IL-2(产品编号200-02)为例加以说明。如下图，重组人IL-2的ED50为0.1ng/ml，我们暂以0.1ng/ml作为其ED50。设想欲了解1mg联科生物技术有限公司全国免费电话：8008571184IL-2中所含的细胞因子单位数，我们先将1mgIL-2配成1mg/ml的原液，倍比稀释后各取1ml来检测生物活性。根据其ED50值(0.1ng/ml)，表明将1mg/ml的IL-2稀释(1mg/ml0.1ng/ml)=107倍时可引起50%的最大生物反应，此时IL-2的稀释度为1/107，进而推知1/107倍稀释的IL-2即为1个Unit，也可得知在1mgIL-2中含有107Units。因此1mg细胞因子中所含的活性单位(Units)可以理解为将1mg/ml细胞因子原液稀释成ED50的稀释倍数，可用下面的公式直接计算：=1x106Units/mg1(mg/ml)ED50(ng/ml)1x106(ng/ml)ED50(ng/ml)ED50==注意事项：各公司或实验室所给出的活性单位多为自己实验室内用特定检测细胞而测得，因各处的培养条件，检测方法等差异，导致各公司或实验室对同一细胞因子的活性单位值的可参照性不够。最好的解决方法是将各公司或实验室的细胞因子与国际公认的标准品对比后得出标准国际单位(U)。国际标准品可国际参考标准品可